Un microscopio óptico es con frecuencia uno de los dispositivos centrales en un laboratorio de investigación de ciencias de la vida. Se puede utilizar para diversas aplicaciones que arrojan luz sobre muchas cuestiones científicas. Por lo tanto, la configuración y las características del microscopio son esenciales para la resolución de la aplicación, que va desde el campo claro hasta la captura y el procesamiento de imágenes de células vivas, pasando por la microscopía de fluorescencia. Este artículo ofrece una breve descripción de las características relevantes del microscopio y aborda las preguntas clave que deben tenerse en cuenta al elegir un microscopio de investigación.
¿Qué tipo de muestras utiliza?
Una de las primeras cuestiones que debe tener en cuenta al elegir un microscopio de investigación es el tipo de muestras que desea explorar. Para muestras fijas montadas en un portaobjetos fino, puede utilizar un microscopio vertical. Las células vivas requieren características especiales del microscopio porque se conservan en recipientes de cultivo celular relativamente grandes que se llenan con medios de cultivo celular. Únicamente una configuración invertida, con el objetivo debajo y el condensador encima de la muestra, permite disponer del espacio libre indispensable y de la proximidad requerida entre el objetivo y la muestra. Al mismo tiempo, un microscopio invertido mantiene una buena accesibilidad a las células, p. ej., para añadir micromanipuladores. Además, las células vivas necesitan un entorno adecuado para sobrevivir. La temperatura y la concentración de CO2 deben mantenerse en niveles determinados. Se necesita una cámara climática con los controladores correspondientes para cumplir con esta tarea.
Izquierda: Portaobjetos para montar muestras fijas, p. ej., secciones histológicas. Derecha: Placa de Petri para el cultivo celular.
Izquierda: Un microscopio vertical presenta el objetivo encima y el condensador debajo de la muestra. Esta disposición es perfecta para observar muestras montadas sobre portaobjetos. Derecha: En un microscopio invertido, esta configuración se gira para ofrecer a los usuarios más espacio además de la proximidad requerida entre el objetivo y la muestra, que se coloca en recipientes más grandes, p. ej., células vivas.
¿En qué dimensiones está pensando?
Las muestras microscópicas presentan tres dimensiones: longitud, anchura y altura. Mientras que algunas muestras, como las secciones histológicas, se capturan solo en la dirección xy, existen otras aplicaciones que requieren la captura también en la dimensión z. Para capturar volúmenes 3D, p. ej., de células vivas, se recomienda un enfoque motorizado que pueda guiar su muestra paso a paso a través del enfoque. El software de captura y procesamiento de imágenes debe ser capaz de reconstruir las imágenes individuales para la visualización en 3D. Para las células vivas, debe añadir la dimensión tiempo. En este caso, por ejemplo, la estabilidad del sistema es otra característica fundamental. Dado que los cambios de temperatura influyen en el sistema de captura y procesamiento de imágenes durante la captura, resultan esenciales unas efectivas medidas correctoras. Un ajuste automático del enfoque, como el control de enfoque adaptable (AFC), contrarresta estas influencias térmicas y siempre encuentra el enfoque predefinido.
El control de enfoque adaptable (AFC) estabiliza automáticamente el enfoque del microscopio incluso en capturas a intervalos de tiempo a largo plazo. Un sensor detecta los movimientos de un rayo luminoso LED (850 nm) que se produce si el cubreobjetos de vidrio que contiene la muestra cambia su posición, p. ej., a causa de la actividad térmica.
¿Qué método de contraste se adapta mejor a su muestra?
La mayoría de las células, especialmente las células animales, examinadas con un microscopio no tienen suficiente contraste intrínseco para que se vean los detalles más finos. Los investigadores usan métodos de contraste para solucionar este problema. Mientras que el contraste de fases (PH) y el contraste diferencial de interferencia (DIC) manipulan la luz que pasa a través de la muestra para añadir contraste, esta también se puede teñir con tinción fluorescente (inmunofluorescencia) con el uso, respectivamente, de proteínas fluorescentes. De acuerdo con el método de contraste, el microscopio necesita un equipo específico, p. ej., el contraste de fases necesita objetivos especiales, mientras que el DIC utiliza ciertos prismas que deben insertarse en la trayectoria de luz. Para la microscopía de fluorescencia se necesitan bloques de filtros especiales que permitan las longitudes de onda de luz correctas para entrar y salir de la muestra.
Serie de células neuronales capturadas con diferentes métodos de contraste. De izquierda a derecha: Campo claro, DIC, contraste de fases, fluorescencia
¿Y con respecto a la fuente de luz?
La elección del método de contraste también determina la fuente de luz. La iluminación diascópica para la microscopía de campo claro convencional, el contraste de fases y el DIC puede realizarse con iluminación halógena o LED. La microscopía de fluorescencia se puede realizar con iluminación LED o con la ayuda de lámparas de mercurio, xenón o halogenuros metálicos de mercurio.
¿Desea documentar o publicar sus resultados?
Si desea tomar una imagen de su muestra o capturar imágenes de células vivas, necesita una cámara digital para el microscopio. Especialmente en el caso de la captura de imágenes de fluorescencia de células vivas, se recomienda una cámara sensible para minimizar la cantidad de luz de excitación, que puede dañar las células. Además de las consolidadas cámaras CCD y EMDDC, las cámaras sCMOS de hoy en día tienen su espacio gracias a su alta eficacia cuántica y velocidad de captura. Para obtener más información acerca de las cámaras digitales para microscopios, lea el artículo «Introducción a la tecnología de la cámara digital». Además, un gran campo visual (FOV) ayuda a encontrar áreas interesantes con mayor rapidez y a capturar imágenes de más células al mismo tiempo. Los microscopios de investigación modernos cuentan con un FOV de 19 mm en el puerto de la cámara que se ajusta perfectamente a un chip de cámara sCMOS de 19 mm. Con frecuencia, no basta con solo tomar una imagen de su muestra, sino que debe analizar los datos que ha capturado. A tal efecto, el sencillo software de captura y procesamiento de imágenes y análisis ayuda a obtener datos cuantitativos y a llevar a cabo un análisis sólido de los datos.
¿Desea manipular sus células en el microscopio?
En los últimos años, la fotomanipulación de las muestras ha ganado popularidad. Esto significa que los investigadores no solo observan las células vivas, sino que las manipulan con la ayuda de luz. La recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) es un ejemplo que ayuda a esclarecer los procesos celulares dinámicos. Para este tipo de técnicas de manipulación, a menudo se necesitan fuentes de luz adicionales que se deben integrar en la trayectoria de luz del microscopio. Este enfoque no es banal. El Leica Infinity Port es una solución universal que acopla fuentes de luz adicionales en la trayectoria de luz del microscopio sin alterar la calidad de la imagen para realizar, p. ej., FRAP, fotoconmutación, ablación u optogenética. Con el adaptador adecuado, los investigadores pueden incluso acoplar sus dispositivos caseros.
El módulo Leica WF FRAP (caja negra a la izquierda) se puede conectar con el microscopio de investigación invertido Leica DMi8 a través del Infinity Port
¿Cuál es su presupuesto?
Una cuestión importante es cuánto dinero puede invertir. Algunos proveedores de microscopios ofrecen configuraciones predefinidas que son aptas para aplicaciones especiales. ¿Pero qué ocurre si no necesita todos los componentes preconfigurados por los que está pagando? Por este motivo, una configuración libre de los componentes puede resultar más barata que comprar un sistema de microscopio predefinido. Además, los requisitos de un microscopio pueden cambiar con el tiempo. En este caso, un sistema actualizable tiene ciertas ventajas. Con una configuración predefinida y fija, puede encontrarse atado a una cantidad limitada de aplicaciones. La capacidad de actualización le ofrece la libertad de crecer a medida que sus necesidades cambian. Teniendo en cuenta estos puntos, una plataforma de microscopía modular, como el Leica DMi8, permite al investigador comenzar con un sistema de microscopio económico que se puede actualizar más adelante y crecer con sus necesidades.
Gracias a su modularidad, el Leica DMi8 se puede configurar según las necesidades de los investigadores. Además, se puede actualizar más adelante si cambian los requerimientos.
¿Quién utilizará el microscopio?
La gama de usuarios de microscopios puede ser muy heterogénea. En especial en la universidad, los usuarios pueden ser muy experimentados o principiantes. Por lo tanto, un sistema de microscopio fácil de usar que funcione con un software intuitivo, como el Leica Application Suite X (LAS X), ayuda a que la gente comience rápidamente y capture datos en un instante. El trabajo se simplifica, por ejemplo, gracias a un diseño orientado al flujo de trabajo, a asistentes de análisis de imágenes y a una perfecta integración con los aparatos periféricos del sistema. Además de los microscopios de investigación de campo amplio, los microscopios estereoscópicos también se utilizan con frecuencia en los laboratorios de investigación de las ciencias de la vida. Obtenga más información en el artículo «Factores que deben tenerse en cuenta al elegir un microscopio estereoscópico».
