FRET sin contaminación utilizando pilas FLIM λ

Mediante FLIM, la eficiencia de FRET se calcula a partir de la diferencia de ciclo de vida del donante en ausencia y presencia del receptor. Para lograr una cuantificación fiable, la ventana de detección debe corresponderse con el espectro de emisiones del donante. Debe excluir cualquier otra fluorescencia, como la autofluorescencia o la fluorescencia de receptores.

Encontrar el rango de detección correcto puede ser una tarea de dedicación intensa cuando se deben cambiar los filtros de paso de banda. Una perspectiva más rápida y práctica se basa en la detección con resolución espectral. El asistente de FLIM contiene un modo xyλ que permite al usuario automatizar el registro de un escaneado de longitud de onda. Esta opción está disponible exclusivamente para sistemas que contienen detectores de SP FLIM internos.

Muestra: identifique el rango de detección espectral óptimo para FRET objetivo (consulte los pasos 1 al 4 ).
GFP, tándem GFP-mCherry, GFP+mCherry se expresaron en células HeLa. Se adquirió una serie FLIM λ de las tres muestras. El gráfico del ciclo de vida medio respecto a la longitud de onda de detección muestra que la ventana de detección de FRET óptima está en el rango de 485–545 nm (valores constantes). Cortesía: M. Weiss, J. Szymanski, DKFZ, Heidelberg.

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