¿Qué es un OPO?

Los métodos actuales permiten que la luz alcance aproximadamente cien micras de profundidad con microscopía de fluorescencia confocal o de campo amplio estándar utilizando fuentes de excitación en el rango visible. Por desgracia, resulta imposible penetrar cientos de micras en el tejido cuando se utiliza luz visible. Debido a que la diseminación de luz depende de la longitud de onda, se puede lograr una mejor penetración de los tejidos utilizando longitudes de onda de excitación más largas. Es en este punto donde la excitación con luz infrarroja, los procesos de dos fotones y el OPO (oscilador paramétrico óptimo) pueden mejorar drásticamente la calidad de las imágenes.

¿Cómo se logran longitudes de onda de excitación más largas?
En primer lugar, se necesitan fuentes de láser en la gama de rojos e infrarrojos. Por lo general esas fuentes, denominadas láseres de Ti:Sa (titanio-zafiro), comienzan con longitudes de onda rojas, p. ej. 680 nm, y se extienden hacia los infrarrojos, p. ej. 1.080 nm. En segundo lugar, se necesitan dos fotones para alcanzar el marcador fluorescente aproximadamente al mismo tiempo. A continuación los dos fotones de, por ejemplo, 1.000 nm, tienen juntos la misma energía de una longitud de onda de excitación de aproximadamente 500 nm. Este proceso se denomina obtención de imágenes multifotónicas o de dos fotones. Cuando la longitud de onda máxima del láser IR es de 1.080 nm, la excitación más larga que se puede alcanzar en este proceso de dos fotones es igual a aproximadamente 540 nm. Sin embargo, muchos marcadores y tintes utilizados en la investigación biológica deben excitarse a longitudes de onda más largas y no se pueden utilizar para la obtención de imágenes de dos fotones, a menos que se utilice una longitud de onda de excitación más larga que 1.080 nm. Con un oscilador paramétrico óptico, también llamado OPO, ya puede utilizar longitudes de onda de excitación de hasta 1.300 nm en el proceso de obtención de imágenes de dos fotones. Esto permite excitar tintes con un máximo de excitación en microscopía de un fotón estándar de hasta aproximadamente 650 nm, lo que implica una gran mejora para la obtención de imágenes confocales. Cuantos más tintes se pueden utilizar y alcanzar con el proceso de dos fotones, más información se obtiene de las muestras con profundidades grandes de obtención de imágenes.

¿Cuáles son las aplicaciones del OPO?
Si nos fijamos en la disciplina de la neurociencia, existe un campo llamado conectómica, que está relacionado con las conexiones entre neuronas, o entre células en general. Para obtener una hoja de ruta de conexiones entre células, necesita una visión general grande y una resolución detallada. El objetivo es comprender la función del tejido, observar cómo funcionan los circuitos. Otras muchas áreas de investigación se pueden beneficiar del OPO. Por ejemplo, en la biología del desarrollo resulta fundamental proteger el tejido frente al fotoenvejecimiento durante la obtención de imágenes embrionarias intravitales así como una penetración profunda de tejidos muy diseminados. Aquí, las longitudes de onda más largas generadas por el OPO son la elección óptima. Además, el OPO es útil para utilizar tintes en las gamas de rojo y rojo lejano para la obtención de imágenes multifotónicas. El OPO incluso permite la excitación simultánea de dos tintes en dos longitudes de onda distintas.

Cómo funciona un OPO?
Es importante destacar que un OPO utiliza una óptica no lineal, cuya física subyacente no es sencilla de explicar. Sin embargo, podemos imaginar fotones individuales procedentes de un láser de bomba, que salen de la fuente IR. En un resonador óptico y un cristal no lineal, los fotones de bomba se solapan y producen una señal y una onda complementaria. Esas tres ondas, la bomba, la señal y la onda complementaria, interactúan en el cristal no lineal. La señal, que es la onda que interesa, aumenta su potencia con cada ciclo del resonador. Esto se denomina amplificación paramétrica de la señal, y la bomba pierde potencia en consecuencia. A continuación, la señal se acopla y se utiliza para la obtención de imágenes IR.

¿Qué ofrece Leica Microsystems?
Hemos integrado completamente el control del OPO compacto coherente con nuestro software Leica LAS AF, lo que facilita en gran medida su funcionamiento. El Leica TCS SP8 MP, diseñado para la obtención de imágenes infrarrojas con el OPO, amplía la gama de longitudes de onda de excitación respecto al máximo anterior de 1.080 nm, hasta los 1.300 nm actuales. El usuario puede elegir entre tres modos de funcionamiento: excitación individual o secuencial con 1.040 hasta 1.300 nm únicamente con el OPO; 680 hasta 1.040 nm únicamente con el láser IR de Ti:Sa; o bien excitación simultánea con ambas fuentes de excitación, a 740 hasta 880 nm con el láser de Ti:Sa, y a 1.030 hasta 1.300 nm con el OPO.

Related Images