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SP8 DIVE Leica Leica Microsystems
Intestino delgado de ratón en confeti. Trazador de linaje celular. Cian: CFP; verde: GFP; amarillo: YFP; rojo: RFP. Investigación sobre el cáncer de colon. Muestra cortesía de Jacco van Rheenen. Universidad de Utrecht, Países Bajos.

Disfrute de libertad espectral con 4Tune

El número de marcadores transgénicos no deja de crecer con rapidez.  El SP8 DIVE sigue el ritmo de estos desarrollos y se puede adaptar a los marcadores transgénicos ya existentes, así como a los nuevos, con unos pocos clics de ratón.

Esta libertad espectral se debe al uso de 4Tune, una tecnología nueva y rompedora para la detección no desescaneada. El detector 4Tune le permite adaptarse a la emisión completa y separar espectros muy solapados sin necesidad de recurrir a la restauración matemática.

Con el SP8 DIVE podrá capturar el doble de señal de fluorescencia, lo que se traduce en una mejora de la profundidad de penetración y de la velocidad de captura y procesamiento de imágenes o en una menor fototoxicidad para la captura y procesamiento de imágenes in vivo.

«Los dicroicos convencionales no han sido nunca la elección óptima para distinguir todos los fluoróforos, pero ahora con los detectores espectrales esto no solo es posible, sino mucho más fácil, ya que podemos optimizar realmente la longitud de onda para cada fluoróforo que queramos detectar».

Prof. Dr. Jacco van Rheenen. Universidad de Utrecht, Países Bajos

Alberto Diaspro

Instituto Italiano de Tecnología (IIT), Génova

“Genial para difundir aún más la microscopía multifotónica desde hoy mismo. Supone un salto enorme en lo relativo a la ampliación de la gama de aplicaciones y a la resolución de un montón de problemas relacionados con la variedad de las muestras. Merece la pena destacar la integración eficaz de SHG y las imágenes de dos fotones. 

Creo que la posibilidad de acoplamiento con otras soluciones y productos Leica, incluidos los módulos STED, logrará que esta arquitectura sea ajustable para las distintas necesidades experimentales, desde la resolución espacial/temporal hasta los fluoróforos y métodos de futura aparición.  

Me encanta la posibilidad de controlar y visualizar el llenado del plano focal posterior mediante el aumento o la reducción del haz de iluminación de excitación de dos fotones. Es genial.”

Sophie Allart

Ingeniera de investigación de INSERM, Centro de Fisiopatología de Toulouse-Purpan

“Es asombroso por la modularidad de sus características y porque el uso de cubos de filtros delante de los detectores NDD tiene un gran impacto en la elección de los fluorocromos y, en algunas ocasiones, nos vemos obligados a adaptar la preparación de las muestras y cambiar los fluorocromos. Ahora será mucho más fácil. 

No, estoy convencida. Llevo 10 años usando técnicas de dos fotones, cuatro colores, así que es muy interesante.”

Kees Jalink

Instituto del Cáncer de los Países Bajos

"Acabo de recibir una demostración y estoy estupefacto. Me parece absolutamente maravilloso que todo lo que teníamos para la luz visible ahora lo hayáis conseguido llevar también al infrarrojo. Habéis hecho un trabajo realmente excelente."

Ron Hoebe

LCAM, Centro van Leeuwenhoek para la Microscopía Avanzada, Universidad de Ámsterdam

“Me gusta el nuevo detector espectral dual de fotones. Lo que más me gusta es cómo está integrado en el software.

Soy el administrador de un centro de captura y procesamiento de imágenes, así que cuanto más fácil resulte para el usuario tanto mejor. Tenemos más de 200 usuarios y proporcionarles formación sobre máquinas muy complicadas requiere mucho tiempo.

De manera que, cuanto más fácil e intuitivo sea, mejor.”

Ammasi Periasami

Centro W.M. Keck para la Captura y Procesamiento de Imágenes Celulares, Virginia

“Me gusta el ajuste de las longitudes de onda entre 740 y 920. Es una muy buena opción de lo que se puede usar. Me refiero a cuántas longitudes de onda se quieren usar en función del fluoróforo. Y sí, si se utiliza una longitud de onda y luego se dispone  de dos o tres detectores para hacer pruebas y ajustes, hay un montón de opciones. 

La relación señal/ruido es muy buena; hay flexibilidad en el lado de emisión.

Sin duda, es muy importante ver la facilidad de uso del sistema. Así que eso es lo que busco. Desde que trabajo con Leica, sigo la facilidad de uso del manejo de estas operaciones en dos fotones frente a  operaciones con  un fotón".

[Durante esta demostración efectuada en el Focus on Microscopy 2017 se llevó a cabo la adquisición secuencial de datos de 4 marcadores; para ello se usó un SP8 DIVE equipado con un láser de IR y dos detectores espectrales HyD-NDD. Excitación de 740 nm (Alexa Fluor 350 para mucosidad de células caliciformes, verde Sytox para núcleos celulares), excitación de 920 nm (SHG para colágeno, Alexa Fluor 568 faloidina para actina f).]

Marc van Zandvoort

Universidad de Maastricht, Genética y Biología Celular

“Muy buena ampliación de los sistemas de dos fotones actualmente existentes. Esta ampliación consigue que el sistema sea mucho más flexible en cuanto al uso de los detectores directos  para dos fotones. 

Hasta ahora esta utilización era muy limitada debido a la necesidad de filtros separados. En este sentido, es una ampliación  muy positiva.”

Urs Ziegler

Jefe de Servicio, Centro para la Microscopía y el Análisis de Imágenes, Universidad de Zúrich

"Es muy flexible y muy fácil de usar. No es necesario cambiar los filtros manualmente y puedes usar todas las tinciones que se te ocurran. 

Lo que agradezco es que, básicamente, el software no requiere proporcionar formación a quienes ya conozcan la microscopía de escaneado confocal. No es necesario cambiar los filtros manualmente; DIVE es fácil de usar porque tiene en cuenta las diferentes combinaciones de filtros y tinciones, lo que, a pesar de ser posible, no resulta tan fácil de hacer. Esta ya es de por sí una ventaja fundamental.

Y luego, obviamente, tienes varias tinciones que se pueden usar en tejido vivo, así como segundos y terceros armónicos. Esto se puede hacer de manera muy, muy sencilla usando el SP8 DIVE. Creo que es un gran paso adelante."

Con DIVE y el detector 4Tune todo es más fácil

El detector no desescaneado 4Tune se puede equipar con entre 2 y 4 unidades de detección y se puede configurar a voluntad con detectores híbridos (HyD), fotomultiplicadores (PMT) o una mezcla de ambos. La luz de emisión se separa mediante una combinación de dicroicos variables y filtros de paso de banda. El rango de ajuste de la longitud de onda va desde 380 hasta 800 nm.

La interfaz de usuario de 4Tune permite optimizar el ajuste de la emisión para múltiples marcadores transgénicos con una simple operación de arrastrar y soltar. Gracias a su diseño claro e intuitivo, su manejo es muy sencillo y apenas requiere formación.

Con el SP8 DIVE estará equipado para todos los marcadores transgénicos existentes, así como para los recién desarrollados, y  estará preparado para futuros desarrollos.

Top graph: Rapid increase of markers
Bottom: interfaz de usuario de 4Tune
Pata de ratón. Fibra muscular marcada con Rab5-GFP. IRAPO 40x 1.1. Izquierda: Mejor resolución. Derecha: Penetración más profunda. Usar el ajuste para una penetración más profunda duplica . el brillo. En consecuencia, la profundidad de penetración aumenta. Muestra cortesía de Prof. Rudolf, Universidad de Ciencias Aplicadas, Mannheim.

Explore nuevas dimensiones en profundidad

Con el SP8 DIVE podrá efectuar los ajustes necesarios para conseguir la visión más profunda y el mayor grado de detalle. Todos los haces de excitación se pueden ajustar independientemente de manera óptima para cualquier objetivo usando el nuevo ampliador de haz Vario (VBE).

El VBE posibilita la colocalización optimizada y el correcto equilibro entre resolución y profundidad que más se adecue a su actividad investigadora.

Optimización de la profundidad y la resolución con el ampliador de haz Vario

El ampliador de haz Leica Vario VBE combina un diámetro de haz ajustable con la posibilidad de ajustar la divergencia. Con esta tecnología podrá conseguir la máxima profundidad, una resolución inmejorable y la total corrección del color.

Diámetro del haz ajustable para conseguir el mejor equilibrio entre resolución y profundidad

Puede elegir el mejor equilibrio individual entre resolución y entrada de energía mediante el ajuste del diámetro del haz. Si ensancha el haz, obtendrá una iluminación homogénea del plano focal posterior. En combinación con una alta apertura numérica, se consigue así la máxima resolución.

Estrechar el haz permite la entrada de más energía en el volumen focal, obteniendo una  mejor penetración de la muestra  e  imágenes  a  mayor profundidad. Con el VBE, los haces se pueden ajustar de manera independiente para hasta cuatro longitudes de onda diferentes del láser IR (infrarrojos) a fin de encontrar el mejor equilibrio entre resolución y profundidad (imagen superior).

Divergencia de haz ajustable para la plena corrección del color

La introducción de una divergencia de entrada corrige la aberración cromática axial de diferentes longitudes de onda del IR. Gracias a ello, un mismo punto focal de la muestra se puede excitar con hasta cuatro longitudes de onda de IR (imagen inferior).

Ampliador de haz Vario VBE ajustable
Tibia de ratón. Músculo estriado. Análisis morfológico del desarrollo de la unión neuromuscular.
Verde: GFP – Rab 5 (GTPase, endosomas). Rojo: mCherry – Bif 1. Gris: AF647- Alpha bungarotoxina (NMJ). Muestra cortesía de Prof. Rudolf, Universidad de Ciencias Aplicadas de Mannheim.

Resultados reproducibles para la captura y procesamiento de imágenes multicolor in vivo de gran profundidad

Excitación multicolor: Excite múltiples marcadores transgénicos en un solo experimento con una perfecta separación de colores. O lleve a cabo foto-manipulación de alta precisión de manera localizada y, al mismo tiempo, la captura y procesamiento de imágenes en un volumen de difracción limitado. El SP8 DIVE se puede equipar simultáneamente con hasta tres líneas de excitación ajustables, equilibradas mediante modulación acústico-óptica. Dado que los láseres son sintonizables  hasta 1300 nm, se pueden usar tinciones de color rojo y rojo lejano para experimentos multifotónicos. Una menor dispersión hace posible una mayor profundidad de penetración y da como resultado imágenes brillantes llenas de detalles de las capas profundas.

TuneIR mantiene en todo momento las condiciones perfectas del instrumento para obtener vistas decisivas: Para poder disfrutar siempre de la misma exactitud en los resultados, es fundamental que tanto el instrumento como los haces del IR disfruten de unas condiciones fiables y estables. Con esta finalidad, hemos combinado nuestro ampliador de haz Vario con una novedosa unidad colectora de haces. Así nos aseguramos de proporcionarle unas condiciones reproducibles y perfectas para la captura y procesamiento de imágenes para hasta tres líneas de excitación ajustables y una perfecta colocalización de múltiples marcadores.

Versatilidad y protección de la inversión

El SP8 DIVE se basa en la versátil plataforma SP8.

Toda la gama SP8 se puede combinar con el DIVE, desde la microscopía confocal con superresolución hasta la nanoscopía STED.

Expanda la plataforma siempre que lo necesite y en la dirección adecuada para su investigación, ahora y en el futuro.

top: Versatile platform SP8 (left), Nanoscopy (middle), Super-Resolution (right)
bottom: CARS (left), Light Sheet (middle), SMD (right)