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Siga las interacciones moleculares con FLIM-FRET

La investigación moderna estudia cómo interaccionan las moléculas para llevar a cabo sus funciones vitales. Estudios biomédicos de éxito utilizan FLIM-FRET para explorar dichas interacciones.

SP8 FALCON fija un nuevo estándar de velocidad para instrumentos FLIM: activa el FRET en eventos celulares muy dinámicos. Gracias a él, puede capturar e interpretar los datos de FRET de sus experimentos cotidianos.

Caged cAMP en una célula HeLa que expresa EPAC mT2-dVenus FRET. Respuesta EPAC a la liberación de AMPc mediado por UV (área central). Película grabada a 4 fps. Tamaño de imagen: 256 x 256 píxeles. Escala de colores (tiempo de vida): ns. Courtesy Kees Jalink, Bram van den Broek, NKI, Ámsterdam.
Oscilaciones de calcio tras estimulación con péptido activador de la trombina. La respuesta en cada célula se registra como un cambio en el tiempo de vida. Película grabada a 4 fps. Tamaño de imagen: 256 x 256 píxeles. Escala de colores (tiempo de vida): ns. Cortesía de Kees Jalink, Bram van den Broek, NKI (Ámsterdam).

Supervisión de los cambios rápidos y sutiles con biosensores

Los biosensores tienen una gran capacidad para informar sobre la actividad metabólica, avisando de los cambios de pH, en el microentorno y los mecanismos.

El SP8 FALCON le permite acceder a esta información contenida en el tiempo de vida de fluorescencia, incluso en relación con los eventos ultrarrápidos, como las dinámicas de potencial de membrana. Esta información complementa las potentes imágenes espectrales que proporciona la plataforma SP8.

Es más fiable y sensible que la formación metabólica de imágenes

La autofluorescencia puede resultar una molestia durante la formación convencional de imágenes. SP8 FALCON, sin embargo, la convierte en información útil. Ahora la autofluorescencia puede informar acerca del estado metabólico, de diferenciación celular y de desarrollo de cáncer.

Lo que es más, el SP8 FALCON permite un contraste en la formación de imágenes en tejido vivo, donde el marcado de fluorescencia a menudo resulta poco específico o destroza las condiciones fisiológicas.

Autofluorescencia en células de mamíferos en condiciones no fisiológicas (pH 8,5). La señal se relaciona con cambios en el pool endógeno de NAD/NADH. El desarrollo de estrés oxidativo se interpreta como una disminución del tiempo de vida de la fluorescencia. Tamaño original de la imagen: 512 x 512 píxeles. Escala de colores (tiempo de vida): Adquisición de imágenes bifotónica realizada con SP8 DIVE y SP8 FALCON.
Intensity
FLIM

Separación de fluoróforos más allá de las opciones del espectro

El marcado de fluorescencia es la forma habitual de diferenciar las estructuras intracelulares. La separación espectral es muy potente, pero en ocasiones puede verse limitada si los espectros de emisión están muy próximos.

Gracias al SP8 FALCON, se puede superar este límite utilizando la dimensión adicional de tiempo de vida de fluorescencia. Esto libera el potencial de separar múltiples sondas de fluorescencia.

Además, al combinar diferentes opciones de la plataforma SP8, conseguirá una mayor libertad. Las opciones incluyen el láser de luz blanca como fuente de excitación, el divisor de haz acústico-óptico y la detección espectral multicanal.

Imagen: Estructuras citoesqueléticas diferenciadas por contraste de tiempo de vida. Vimentina inmunoetiquetada con Alexa Fluor 555 (verde), y tubulina inmunoetiquetada con Alexa Fluor 546 (azul). Los fluoróforos son muy similares desde el punto de vista de los espectros, pero están separados gracias a la información de tiempo de vida de la fluorescencia. Tamaño imagen: 512 x 512 píxeles.

Formación de imágenes con el SP8 FALCON (FAst Lifetime CONtrast)

El microscopio SP8 FALCON supera las limitaciones de velocidad del FLIM y permite recopilar datos de tiempo de vida en alta velocidad.

Hasta ahora, era difícil obtener información funcional a partir de los datos de tiempo de vida de fluorescencia de procesos rápidos debido a las restricciones técnicas que plantea la técnica FLIM. La velocidad de adquisición de la FLIM era, como mínimo, diez veces menor que la correspondiente al registro en confocal de imágenes por intensidad.

La microscopía de contraste de tiempo de vida de alta velocidad ofrecida por el SP8 FALCON permite realizar el seguimiento de procesos dinámicos en las células a un ritmo óptimo. Estas tareas son posibles gracias al nuevo método de medición de tiempo mediante TCSPC (time-correlated single photon counting o recuento de fotones individuales correlacionado con el tiempo), en combinación con algoritmos inteligentes para el manejo y análisis de datos.

Imagen de canal único de beads fluorescentes (magenta) en una solución con Alexa Fluor 555 (verde). La separación de fluoróforos basada en tiempo de vida de fluorescencia es posible a diferentes velocidades, por ejemplo, 16 fps (arriba), 27 fps (velocidad del vídeo, centro) y 83 fps (ultrarrápida, abajo). El uso de la información de tiempo de vida para la separación de marcadores tiene considerables ventajas respecto a la intensidad (escala de grises). Los vídeos muestran píxel por píxel el ajuste de los componentes del tiempo de vida. Tamaño del cuadro: 512 x 64 píxeles. Escala: 10 µm.
Captura directa de muestras complejas. Mosaico de alta resolución con 722 partes de un embrión de ratón, con 190 megapíxeles. Datos FLIM con cuatro tiempos de vida de fluorescencia característicos, codificados por colores. Captura: 1:23 h. Análisis: 1:00 h.

Formación de imágenes multimodal todo en uno

Nunca había sido tan fácil combinar el FLIM con otras modalidades como con el SP8 FALCON. Hasta ahora, los investigadores tenían que lidiar con un cableado complicado y tediosas tareas de transferencia de archivos, pero con el SP8 FALCON, hoy se puede integrar la información de tiempo de vida con el flujo de trabajo confocal estándar.

El SP8 FALCON está totalmente integrado en el software de captura y análisis LAS X. Puede registrar FLIM en cuatro canales espectrales al mismo tiempo y hasta en 10 canales de forma secuencial. El SP8 FALCON le proporciona acceso a contrastes de tiempo de vida en series en 3D, secuencias temporales e incluso formato de gran mosaico.

Con el nuevo LAS X NAVIGATOR, puede expandir el área de visión hasta 10 000 veces, lo que le permitirá ahorrar un tiempo muy valioso a la hora de identificar las zonas de interés y analizar las muestras de una forma totalmente nueva.

Definición del tiempo de vida con fasores en un instante

El análisis con SP8 FALCON, que utiliza fasores FLIM, proporciona una visualización 2D de los componentes del tiempo de vida.

Con los fasores FLIM puede seguir los cambios en el microentorno, seleccionar componentes para multiplexar la señal y determinar la eficiencia de FRET.

FLIM con fasores permite mejorar la resolución en imágenes STED. Es posible lograr la misma resolución con menos potencia de apagamiento STED (Lanzanò et al., Nature 2015).

Células marcadas con Alexa555-Phalloidin y H2B mCherry. Separación realizada utilizando fasores FLIM. El gráfico de fasor muestra claramente dos distribuciones. Cortesía: Dr. Martin Stöckl, Departamento de Biología de la Universidad de Constanza (Alemania).

Los resultados que necesita, con tan solo un clic

El software LAS X permite efectuar FLIM con unos pocos clics del ratón y la misma filosofía que la formación rutinaria de imágenes espectrales.

Incluso si utiliza la microscopía como técnica complementaria, puede descubrir lo más básico y comenzar a capturar imágenes directamente.

Existen otras funciones más especializadas disponibles, como flujos de trabajo y la posibilidad de automatizar según le convenga.

Filosofía de 1 clic para que pueda centrarse en la ciencia: SP8 FALCON controlado por el software LAS X

Estudie la dinámica molecular con SP8 FCS

La espectroscopía de correlación de fluorescencia ( FCS ) es una técnica cuantitativa en microscopía. Se aplica para estudiar la concentración de partículas, el coeficiente de difusión, la viscosidad, la masa molecular, la constante de unión y las propiedades fotofísicas basándose en las fluctuaciones de intensidad.

La combinación de FCS con FLIM permite realizar experimentos de espectroscopía de correlación de tiempo de vida de fluorescencia  (FLCS). La FLCS se usa para estudiar la interacción de moléculas que no son separables espectralmente y para eliminar el "ruido de fondo".

STED disminuye el volumen focal. Por esta razón, STED FCS proporciona información molecular incluso en rangos de alta concentración (>100 nM) donde el confocal FCS encuentra su límite.

Imagen superior: Trazas de intensidad y curvas de autocorrelación para diferentes concentraciones de Atto488, la amplitud disminuye al aumentar la concentración. Imagen inferior: volumen de excitación en el caso de microscopía confocal (izquierda) y STED 3D (derecha). El volumen más pequeño en el caso de STEDpermite la medición de fluctuaciones a una mayor concentración molecular.

Comentarios de los expertos

"Hemos examinado el Leica SP8 FALCON ; es tan preciso como las soluciones TCSPC, pero su interfaz es muy intuitiva y funciona muy rápido. En mi opinión, es un cambio radical en el procesamiento funcional de imágenes»." - Kees Jalink, doctor en el Instituto del Cáncer de los Países Bajos, Ámsterdam

"La nueva solución FLIM/FCS de Leica potenciará sus ámbitos de aplicación, ya que es muy rápida, flexible y fácil de usar."Prof. Christian Eggeling, Universidad de Oxford

"La mayoría de los instrumentos FLIM son accesorios, lo que supone una perspectiva radicalmente nueva: el sistema está totalmente integrado y es muy potente!" - Prof. Enrico Gratton, UCI Samueli, Universidad de California, Irvine

"El SP8 FALCON Leica es el primer sistema comercial que ofrece una formación integrada de imágenes confocales y de tiempo de vida que yo puedo imaginar usar en un entorno de servicio de microscopia." - Vicerrector/profesor Scott E. Fraser, doctor en la Universidad del Sur de California, Los Ángeles

Parte superior: Plataforma versátil SP8 (izquierda), nanoscopía (centro), superresolución (derecha)
Parte inferior: CARS (izquierda), lámina de luz (centro), multifotónica (derecha)

Miembro de la familia TCS SP8

El SP8 FALCON es la última incorporación a la plataforma SP8 establecida de Leica Microsystems. La plataforma se puede configurar para adaptarse a distintas formas de investigación, desde la microscopía confocal con superresolución hasta la nanoscopía STED.

Para los usuarios, esto aporta tanto versatilidad como protección de la inversión.

Todos los instrumentos de la plataforma SP8 son de libre acceso y pueden adaptarse a la investigación del usuario, ahora y en el futuro.