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Conceptos básicos de microscopía confocal

Principio básico de microscopía confocal

En el microscopio confocal, todas las estructuras no enfocadas se suprimen en la formación de la imagen.

Esto se logra mediante una disposición de diafragmas que, en puntos conjugados ópticamente de la trayectoria de los haces, actúan como una fuente de luz de puntos y como un detector de puntos, respectivamente.

Los haces procedentes de partes no enfocadas se suprimen mediante el "estenopo" de detección.

La profundidad del plano focal, además de la longitud de onda de la luz, se determina en particular por la apertura numérica del objetivo utilizado y el diámetro del diafragma.

Con un "estenopo" de detección más amplio, se puede reducir el efecto confocal.

Para obtener una imagen completa, el punto de imagen se mueve por la muestra mediante espejos de escaneado.

La luz emitida/reflejada que atraviesa el "estenopo" de detección se transforma en señales eléctricas mediante un fotomultiplcador y se muestra en la pantalla de ordenador.

Ventajas de los microscopios confocales

Las principales ventajas que ofrece un microscopio confocal respecto a las características de un microscopio convencional se pueden resumir como sigue:

  • Los haces luminosos procedentes del exterior del plano focalno se registrarán.
  • El desenfoque no crea zonas borrosas, pero corta gradualmente partes del objeto a medida que se alejan del plano focal. Así, estas partes se oscurecen y llegan a desaparecer. A esta característica se la denomina seccionado óptico.
  • Se pueden registrar conjuntos de datos tridimensionales reales.
  • El escaneado del objeto en la dirección x/y así como en la dirección z (a lo largo del eje óptico) permite visualizar los objetos desde todos los ángulos.
  • Debido a la dimensión pequeña del foco de iluminación en el plano focal, la luz parásita se minimiza.
  • Mediante el procesamiento de imágenes, se pueden superponer numerosos cortes para generar una imagen de enfoque extendido que solo se puede lograr en microscopía convencional mediante la reducción de la apertura y, por tanto, sacrificando resolución.