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Première cryotomographie électronique intégrée

Révéler des mécanismes cellulaires en 3D à une résolution sub-nanométrique

Pour approfondir la compréhension des mécanismes biologiques complexes, les chercheurs en sciences de la vie ont besoin, dans le contexte cellulaire, d'informations structurelles fiables de molécules cibles. Pour y parvenir, les molécules cibles et leur environnement cellulaire doivent être résolus de manière précise à une résolution sub-nanométrique. 

La collaboration de Leica Microsystems et Thermo Fisher Scientific a permis de mettre au point un processus de Cryo Tomographie électronique entièrement intégré qui répond aux besoin de la recherche. Un transfert sûr, des échantillons et des données  entre les instruments, assure une navigation aisée vers les zones cellulaires cibles et permet des résultats fiables à une résolution sub-nanométrique.

Les données ont été offertes par le département de biologie structurale moléculaire, Institut de biochimie Max Planck, Martinsried, Allemagne

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Nos experts en solutions pour applications de cryotomographie électronique sont ravis de vous prodiguer des conseils.

Produits Cryo Clem 5

Filter by Area of Application
Ensemble Leica EM Cryo CLEM monté sur un Leica DM6000 FS

EM Cryo CLEM

Corrélation d'échantillons biologiques cryofixés en microscopie optique et électronique grâce au

Congélateur à haute pression Leica EM ICE

Leica EM ICE

Système de congélation haute pression avec stimulation lumineuse optionnelle

Vacuum Cryo Transfer System Leica VCT500

Leica EM VCT500

Système de transfert cryo sous vide

Métalliseur/Évaporateur haute résolution sous vide secondaire Leica EM ACE600

Leica EM ACE600

Métalliseur/Évaporateur haute résolution sous vide secondaire

Leica EM FC7 ‐ Chambre cryo pour Leica EM UC7 et EM UC6

Leica EM FC7

Chambre cryo pour Leica EM UC7 et EM UC6 -

Workflow de Cryo Tomographie électronique

Étape 1 : vitrification

Les cellules examinées sont cultivées sur une grille de microscopie électronique.

Avant la congélation, l'échantillon est conservé à une température stable dans une chambre climatique à humidité contrôlée.

L'échantillon est alors vitrifié par plongeon dans le cryogène secondaire de l’automate EM GP2.

Le processus de vitrification inhibe la formation de cristaux de glace assurant ainsi que le contenu des cellules est aussi proche que possible de l'état natif.

Étape 2 : sélection

Pour un processus efficace, il convient de présélectionner des cellules et régions cibles adéquates. Pour cela on utilise le cryomicroscope photonique Leica EM Cryo CLEM. L'échantillon peut ensuite être transféré vers le FIB Thermo Scientific™ Aquilos™ pour y être préparé. Une connectivité totale entre les instruments signifie que la région et les coordonnées définies sur le Cryo Microscope photonique sont transférées en toute sécurité et de manière précise pour un repérage immédiat des zones d’intérêt par l'Aquilos. Vous ne perdez plus de temps à retrouver vos zones d‘intérêt !

Afin d'éviter la contamination d'échantillons précieux, le workflow de Cryo Tomographie permet un transfert sûr de l'échantillon entre les systèmes. Le système à cartouches dédié protège votre échantillon tout au long du processus et fournit des bases solides pour des résultats scientifiques fiables.

(Thermo Scientific, Krios et Aquilos sont des marques déposées de Thermo Fisher Scientific.)

Étape 3 : Polissage FIB

Après la présélection et le ciblage dans l'EM Cryo CLEM, l'échantillon est transféré vers le Thermo Scientific Aquilos, Cryo DualBeam dédié.

Jusque-là, il était impossible de résoudre l'intérieur des cellules à une résolution sub-nanométrique car de nombreux échantillons étaient simplement trop épais pour être visualisés en Cryo Tomographie électronique. 

L'Aquilos surmonte les limites imposées par l'épaisseur en employant un faisceau électronique à balayage (MEB) et une colonne FIB. Le faisceau électronique est utilisé pour l'imagerie, tandis que le faisceau d'ions gallium assure l’usinage précis des cellules vitrifiées. 

Grâce à l’usinage par FIB, de fines lamelles d’échantillon vitrifié sont préparées sur grille ; On pourra ensuite les explorer en Cryo tomographie électronique. 

Étape 4 : Cryotomographie 3D

La grille TEM qui porte les cellules, et les lamelles FIB est ensuite transférée de l'Aquilos au Thermo Scientific Krios™ G3i (CryoMET).

On image de nombreuses fois en Cryo MET la zone d'intérêt en inclinant l’échantillon sous différents angles entre chaque prise de vue.

Les différentes images sont alignées par ordinateur et l’on reconstruit une image 3D de la lamelle : Le tomogramme avec résolution sub-nanométrique.