Un microscope optique est souvent l'un des dispositifs centraux d'un laboratoire de recherche en sciences de la vie. Il peut être utilisé pour diverses applications qui apportent un éclairage à de nombreuses questions scientifiques. Par conséquent, la configuration et les fonctions du microscope jouent un rôle crucial dans son champ d'applications, du fond clair à la microscopie en fluorescence et à l'imagerie de cellules vivantes. Cet article présente succinctement les fonctions pertinentes du microscope et aborde les questions clés que l'on devrait se poser lors du choix d'un microscope de recherche.
De quel type est l'échantillon que j'utilise ?
L'une des premières choses à prendre en compte lors du choix d'un microscope de recherche est le type d'échantillon à explorer. Pour les échantillons fixés qui sont montés entre lame et lamelle, vous pouvez utiliser un microscope droit. Les cellules vivantes nécessitent un microscope aux caractéristiques spéciales, parce qu'elles sont placées dans des récipients de culture cellulaire relativement grands qui sont remplis de milieu de culture. Seule une configuration de microscope inversé, où l'objectif est au-dessous de l'échantillon et le condenseur au-dessus, procure l'indispensable espace libre et la proximité requise de l'objectif et de l'échantillon. De même, un microscope inversé permet d'accéder facilement aux cellules, p. ex. lors de l'ajout de micromanipulateurs. De plus, les cellules vivantes ont besoin pour survivre d'un environnement adéquat. La température et le taux de CO2 doivent être maintenus à certains niveaux. Pour remplir cette tâche, il est nécessaire d'avoir une chambre d’incubation avec les contrôleurs correspondants.
gauche : lame porte-objet pour le montage d'échantillons fixés, p. ex. des coupes histologiques. Droite : boîte de Pétri pour culture cellulaire.
gauche : un microscope droit, avec l'objectif au-dessus de l'échantillon et le condenseur en dessous. Cette disposition est parfaite pour observer un échantillon monté entre lame et lamelle en verre. Droite : sur un microscope inversé, cette configuration est inversée pour donner aux utilisateurs davantage d'espace et rendre l'objectif proche de l'échantillon, qui est placé dans un grand récipient contenant p. ex. des cellules vivantes.
Combien de dimensions avez-vous à l’esprit?
L'échantillon microscopique a trois dimensions : longueur, largeur et hauteur. Alors que les images de certains échantillons tels que les coupes histologiques ne sont prises qu'en deux dimensions, x et y, d'autres applications ont besoin que l'acquisition intègre aussi la dimension z. Pour acquérir des images en volumes 3D, p. ex. de cellules vivantes, il est recommandé d'avoir une tourelle porte-objectifs motorisée dont les fonctions faciliteront la mise au point de l'échantillon. Le logiciel d'imagerie pourra reconstituer des images isolées pour la visualisation 3D. Pour les cellules vivantes, vous devez ajouter la dimension temporelle. Auquel cas, la stabilité du système est une autre donnée critique. Du fait que les changements de température ont une influence sur le système d'imagerie lors de l'acquisition, il est essentiel de prendre des mesures efficaces pour y remédier. Une mise au point automatique telle que l’Auto-Focus Adaptatif (AFC) neutralise ces influences thermiques et retrouve toujours la mise au point prédéfinie.
l’Auto-Focus Adaptatif (AFC) stabilise automatiquement la mise au point du microscope, même lors d'une acquisition dans le temps avec observation en Time-Lapse. Un capteur détecte les mouvements d'une diode ( 850 nm) qui se produisent si le couvre-objet portant l'échantillon change de position en raison p. ex. d'une activité thermique.
Quelle méthode de contraste convient le mieux à votre échantillon ?
La majorité des cellules – en particulier animales – examinées au microscope ont un contraste intrinsèque insuffisant pour que l'on puisse voir les détails les plus fins. Les chercheurs utilisent des méthodes de contraste pour résoudre ce problème. Alors que le contraste de phase (PH) et le contraste interférentiel différentiel (CIT) utilisent la lumière qui traverse l'échantillon pour ajouter du contraste, vous pouvez aussi colorer celui-ci avec des sondes fluorescentes (immunofluorescence) ou bien utiliser des protéines fluorescentes. Selon la méthode de contraste utilisée, le microscope a besoin d'un équipement spécifique : p. ex. le contraste de phase nécessite des objectifs spéciaux, alors que la méthode DIC recourt à des prismes introduits dans le trajet optique. La microscopie en fluorescence requiert des cubes de filtres spéciaux qui permettent à la lumière de la longueur d’onde appropriée d'accéder à l'échantillon et à celui-ci d'en émettre.
série d’images de cellules neuronales acquises avec des méthodes de contraste différentes. De gauche à droite : fond clair, CIT, contraste de phase, fluorescence
Qu'en est-il de la source de lumière ?
Le choix de la méthode de contraste détermine aussi la source de lumière. L'éclairage par transmission pour la microscopie classique à fond clair, le contraste de phase et le contraste CIT peut être obtenu avec une lampe halogène ou des LED. La microscopie en fluorescence peut être effectuée soit avec un éclairage à LED, soit à l'aide de lampes au mercure, au xénon, ou au mercure associé à des halogénures métalliques.
Voulez-vous documenter ou publier vos résultats ?
Si vous voulez prendre une image de votre échantillon ou faire de l'imagerie de cellules vivantes, vous avez besoin d'une caméra numérique dédiée à la microscopie. En particulier dans le cas de l'imagerie de cellules vivantes en fluorescence, il est recommandé d'avoir une caméra sensible pour réduire la lumière d'excitation qui risque de nuire aux cellules. En plus des caméras CCD et EMDDC qui ont fait leurs preuves, les caméras sCMOS s'imposent de nos jours de plus en plus en raison de leur efficience quantique et de leur vitesse d'acquisition élevées. Pour en savoir plus sur les caméras numériques en microscopie, veuillez lire l'article Introduction à la technologie des caméras numériques. De plus, un grand champ de vision (FOV) aide à trouver plus rapidement des zones intéressantes tout en prenant des images d'un plus grand nombre de cellules. Les microscopes de recherche modernes disposent sur le port de la caméra d'un champ visuel de 19 mm qui correspond parfaitement au capteur de 19 mm d'une caméra sCMOS. Souvent, il ne suffit pas de prendre une image de votre échantillon, vous devez aussi analyser les données acquises. Dans ce but, un logiciel d'imagerie et d'analyse simple à utiliser et convivial vous aide à obtenir les données quantitatives et en faire une bonne analyse.
Voulez-vous manipuler des cellules examinées au microscope?
Ces dernières années, la photo-manipulation des échantillons s'est répandue. Cela signifie que les chercheurs ne se contentent plus d'observer les cellules vivantes, mais qu'ils les manipulent à l'aide de la lumière. La récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP), par exemple, sert à identifier les processus cellulaires dynamiques. Pour les techniques de manipulation de ce genre, on a souvent besoin de sources de lumière supplémentaires qu'il faut intégrer au trajet optique du microscope. La démarche n'est pas simple. Le Port Infinity de Leica est une solution universelle qui couple les sources de lumière supplémentaires au trajet optique du microscope sans perturber la qualité d'image, pour effectuer, p. ex., une expérience FRAP, une photo-commutation, une ablation ou de l'optogénétique. Avec le bon adaptateur, les chercheurs peuvent même coupler leurs dispositifs faits maison.
le module FRAP à champ large de Leica (le boîtier noir à gauche) peut être connecté au microscope de recherche inversé Leica DMi8 via le Port Infinity
Quel est votre budget ?
L'argent dont vous disposez est un élément important. Certains fournisseurs de microscopes offrent des configurations prédéfinies qui sont adaptées à des applications spéciales. Mais qu'en est-il si vous n'avez pas besoin de tous les composants préconfigurés que vous payez ? C'est pourquoi il peut être plus économique de choisir librement la configuration des composants que d'acheter un système microscopique prédéfini. De plus, les exigences relatives à un microscope peuvent évoluer dans le temps. Auquel cas, un système évolutif présente certains avantages. Avec une configuration prédéfinie et fixe, vous pouvez vous trouver lié à un nombre limité d'applications. L'évolutivité vous donne la liberté de croître quand vos besoins changent. En prenant ces points en compte, une plate-forme modulaire de microscopie telle que Leica DMi8 permet au chercheur de commencer par un système microscopique abordable, qui peut ultérieurement être mis à niveau et évoluer selon les besoins.
grâce à sa modularité, le Leica DMi8 est configurable en fonction des besoins des chercheurs. Il est de plus possible d'effectuer des mises à niveau ultérieures du système, si les besoins changent.
Qui utilisera le microscope ?
Les utilisateurs du microscope peuvent être très divers. En particulier à l'université, les utilisateurs peuvent être très expérimentés ou des débutants absolus. Ainsi, un système de microscopie facile à utiliser et commandé par un logiciel intuitif tel que Leica Application Suite X (LAS X) aide les utilisateurs à débuter en peu de temps et acquérir rapidement des données. Par exemple, la conception en « workflow » , les assistants d'analyse d'image et l'intégration simplifié des périphériques dans le système simplifient votre travail. À côté des microscopes de recherche à grand champ, les stéréomicroscopes sont souvent utilisés dans les laboratoires de recherche en sciences de la vie. Vous trouverez des informations détaillées dans l'article « Factors to Consider When Selecting a Stereo Microscope » (Facteurs à prendre en compte lors du choix d'un stéréomicroscope).
