Ajoutez de la polyvalence à vos recherches

En complétant votre système STELLARIS 5 ou STELLARIS 8 avec le DLS, vos recherches sont plus polyvalentes, ce qui vous permet d’imaginer facilement différents types d’échantillons en trois dimensions avec une manipulation simple et des expériences multipositions.

Le module DLS est conçu pour améliorer vos expériences d’imagerie cellulaire in vivo, augmentant la viabilité cellulaire grâce à un éclairage sur une tranche optique unique et une imagerie rapide avec une caméra sCMOS. En plus des échantillons vivants, le DLS permet également d’obtenir d’échantillons clarifiés, pour une flexibilité accrue, et d’atteindre ainsi vos objectifs de recherche.

Le Vertical Turn – Comment la feuille de lumière s’intègre-t-elle à un confocal ?

La microscopie à feuille de lumière nécessite généralement une configuration optique dédiée sur un système indépendant où les objectifs d’illumination et de détection sont perpendiculaires l’un par rapport à l’autre. Le DLS rend la microscopie à feuille de lumière facilement accessible. Le design unique du miroir TwinFlect dévie la feuille de lumière d’illumination d’un angle de 90°. Cette amélioration permet d’intégrer le trajet du faisceau d’illumination et de détection dans l’axe vertical de chaque système STELLARIS avec microscope inversé. Cette amélioration est apportée sans compromettre la fonctionnalité confocale.

Phototoxicité faible et imagerie des échantillons en 3D : développement de Drosophila melanogaster durant six heures. Échantillon : RFP photosensible. Rendu 3D. Stack 150 µm z, 30 s/stack.

Réaliser et documenter des observations à long terme

L’imagerie nécessite de la lumière, mais une trop grande quantité de lumière peut endommager vos cellules. La microscopie à feuille de lumière est la méthode d’imagerie la plus « douce » à ce jour, car elle réduit les photodommages globaux causés par la phototoxicité et le photoblanchiment. La viabilité de votre échantillon est ainsi automatiquement accrue. La biologie du développement bénéficie en particulier de l’imagerie à feuille de lumière. La combinaison d’une illumination de faible intensité et d’une acquisition à grande vitesse vous permet de suivre des organismes photo sensibles en développement sur de longues périodes, comme un embryon de Drosophile, et de comprendre comment les tissus et les organes se forment en temps réel et en 3D.

Principe de l’imagerie à feuille de lumière

La microscopie à feuille de lumière est une approche très appropriée pour l’imagerie d’échantillons sensibles ou de processus biologiques rapides, du fait de l’illumination de l’échantillon sur un seul plan focal seulement.

Comme il n’y a pas d’excitation en dehors du plan mis au point, les effets phototoxiques sont réduits au plan focal. De plus, en déplaçant l’échantillon à travers la feuille de lumière, vous réalisez automatiquement une coupe optique et pouvez imager les échantillons en 3D.

Images en temps réel : Battements cardiaques d’un cœur de poisson-zèbre, ligne transgénique flik1::EGFP. Alignement post-acquisition après enregistrement xytz. Vitesse d’acquisition : 120 images/seconde. Avec l’aimable autorisation d’Emily Steed, Vermot Lab, IGBMC Strasbourg, France.

Acquisition rapide d’images avec une excellente résolution

Observer des processus biologiques rapides et périodiques en 3D sur une longue période, comme le battement d’un cœur de poisson-zèbre, peut être difficile sans la bonne vitesse d’image et la bonne résolution. Avec le module DLS, vous pouvez choisir entre deux caméras sCMOS de pointe pour une acquisition rapide des images avec une excellente résolution, toutes deux entièrement intégrées dans le logiciel LAS X Light Sheet.

7,5 h d’enregistrement en time-lapse d’un microspheroïde épithélial mammaire en culture 3D. Données gracieusement fournies par le groupe Intelligent Imaging (B. Eismann/C. Conrad) de BioQuant/DKFZ Heidelberg

Exploration de cultures cellulaires 3D, en simultané avec positions multiples

L’imagerie efficace des cultures cellulaires 3D, telles que les organoïdes ou les sphéroïdes, représente un nouveau défi en raison de leurs volumes importants. Les organoïdes peuvent être fixés, immunomarqués et étudiés à l’aide de techniques de clarification, mais aussi observés vivants pour étudier des processus dynamiques. L’étude de ces échantillons avec DLS est simple grâce à des workflows définis et fournit des informations pertinentes sur les processus cellulaires et moléculaires. Le DLS est bien adapté pour répondre aux besoins des préparations vivantes ou clarifiées, ce qui vous donne l’avantage d’étudier les cultures cellulaires 3D qui offrent des conditions d’étude plus physiologiques que la culture cellulaire 2D sur des cellules adhérentes.

Découvrez le workflow complet de biologie cellulaire en 3D  avec la microscopie Digital Light Sheet.

Un système à feuille de lumière pour les échantillons vivants et clarifiés

L’imagerie tissulaire en profondeur est difficile en raison de l’opacité des tissus biologiques. C’est là que le nombre croissant de protocoles de clarification des tissus entre en jeu, mais ils peuvent représenter un défi pour de nombreux systèmes d’imagerie.

Le module DLS fournit non seulement d’excellents résultats avec des échantillons vivants, mais peut également analyser des échantillons ayant subi diverses techniques de clarification. Avec DLS, vous pouvez choisir entre plusieurs objectifs de détection et des supports de montage d’échantillons qui permettent de visualiser les détails structurels dans les tissus et organismes clarifiés.

Conditions d’acquisition vidéo :

  • Objectif de détection HC APO L10x/0,30 W DLS
  • taille de l’image : 1,39 mm x 2,04 mm (dalles 2x3)​
  • Spirale Z : 1,5 mm d’épaisseur (incréments de 2 um, 745 images)​
  • Temps d’acquisition : 5 min 37 s​
  • Excitation : 514 nm
  • Émission : Filtre long pass LP514 nm, temps d’exposition de 6 ms​

Cortex cérébral et hippocampe d’une tranche de cerveau de souris Thy1-YFP-H adulte traités avec SeeDB2G. Images fournies avec l’aimable autorisation des docteurs Meng-Tsen Ke et Takeshi Imai, RIKEN Center, Kobe, Japon.

Cet exemple démontre l’avantage du confocal combiné au DLS. Un embryon transgénique de poisson-zèbre a été marqué pour visualiser les macrophages impliqués dans la réponse immunitaire. Pour étudier leur réaction à une blessure, un laser confocal a été utilisé pour créer une plaie (flèche), et un film a été enregistré en time-lapse. La vidéo montre la réaction dynamique des cellules activées qui migrent maintenant vers la plaie, ce qui déclenche le processus de cicatrisation. Dans ce cas, le passage au DLS permet une imagerie délicate en direct du poisson-zèbre. 

Bénéficie de nombreuses applications supplémentaires

Notre module à feuille de lumière est plus qu’un complément fonctionnel à votre système confocal. STELLARIS et DLS fonctionnent en synergie pour élargir vos possibilités de recherche. Par exemple, vous pouvez manipuler vos échantillons à l’aide de la technologie confocale, puis les imager avec le DLS.

Il suffit de passer du mode confocal au mode feuille de lumière dans le logiciel LAS X. Ainsi, la photoconversion ou les expériences de cicatrisation avec des observations délicates à long terme deviennent faciles et pratiques.

Préparation familière des échantillons

Grâce à la configuration verticale du DLS, vous pouvez conserver la préparation habituelle de vos échantillons. Les spécimens sont montés dans des boîtes de Petri conventionnelles à fond de verre et sont directement accessibles. Vous pouvez analyser plusieurs échantillons lors d’expériences multipositions. Grâce à l’automatisation de la platine motorisée du microscope, plusieurs échantillons peuvent être analysés en une seule configuration expérimentale. Quelle est l’unique condition préalable ? Un espace suffisant pour les miroirs TwinFlect de chaque côté de l’échantillon.

Préparation des échantillons pour le DLS. Les échantillons sont enrobés d’agarose sur des boîtes de Petri à fond en verre. L’agarose en excès doit être retirée pour laisser de la place au miroir TwinFlect.

Outils supplémentaires de manipulation des échantillons

Utilisation de capillaires en verre en forme de U pour le montage de l’échantillon

Les capillaires en verre en forme de U existent en deux tailles différentes. Ainsi, ils s’adaptent aux différents miroirs TwinFlect et peuvent servir de supports optimaux pour le positionnement du ou des échantillons. 
Informations complémentaires

Utilisation d’un dispositif de rotation pour le montage d’échantillons DLS

Avec un indice de réfraction de 1,338, les tubes FEP sont souvent utilisés pour monter les échantillons immergés en solution aqueuse. Afin d’aligner de manière optimale l’échantillon pour l’imagerie, un dispositif de rotation a été conçu pour ajuster l’angle de vue.
Informations complémentaires

Utilisation de cadres d’enrobage pour la préparation des échantillons

Les supports de montage Leica présentés ici offrent un avantage majeur pour la préparation des échantillons nécessaires à l’imagerie DLS : Ils permettent la préparation d’un plus grand nombre d’échantillons. Ils peuvent être utilisés avec des réactifs potentiellement dangereux comme le BABB (Benzyl Alcohol Benzyl Benzoate).
Informations complémentaires

Kit de support de montage (porte-échantillons rectangulaire 24 x 50 mm + porte-échantillons rond diamètre de 30 mm)

Feuille de lumière avec avantages confocaux

Grâce à l’intégration du DLS, votre imagerie à feuille de lumière bénéficie des innovations techniques de votre système STELLARIS. 

Utilisez toujours le bon laser

Tous les lasers visibles de votre microscope confocal STELLARIS sont prêts à être utilisés pour l’imagerie à feuille de lumière. Les diodes laser en option ainsi que le laser blanc (WLL) de nouvelle génération STELLARIS offrent une grande flexibilité dans le choix des fluorochromes adaptés à vos expériences en feuille de lumière. Avec le microscope STELLARIS 8, l’imagerie des fluorochromes en proche infrarouge devient maintenant accessible.

Toujours le bon scanner

Sur les systèmes STELLARIS équipés d’un scanner  tandem, vous pouvez  choisir entre le scanner résonant ou le scanner  de champ de vision (à 1 400 Hz) pour générer la feuille lumineuse scannée. La génération de la feuille de lumière avec le scanner résonant produit des pixel dwell times plus courts, ce qui est bénéfique pour réaliser une imagerie encore plus « douce ».

Design logiciel axé sur les workflows

Le logiciel LAS X guide les utilisateurs pas à pas tout au long de l’acquisition et de l’évaluation des données. Le design logiciel axé sur les workflows vous aide à utiliser l’instrument plus efficacement. Une routine d’étalonnage pratique établit la feuille de lumière avec précision.

Le scanner confocal peut cibler chacun des deux miroirs opposés du système TwinFlect pour une illumination des deux côtés de l’échantillon. Les zones d’ombrage ne représentent ainsi plus un obstacle pour l’imagerie. Pour obtenir des images nettes avec un grand champ de vision, vous pouvez fusionner les deux images à l’aide de l’option de fusion en ligne ou hors ligne de l’assistant LightSheet dans le logiciel LAS X.

Adaptez LAS X à vos besoins avec des modules logiciels supplémentaires. Le module LAS X 3D Visualization offre de nouvelles façons d’interagir avec vos données 3D grâce à un découpage intuitif, un rendu rapide et un affichage stéréo. Les expériences de tilescan vous permettent d’observer de grandes zones. Les expériences de Mark & Find qui vous permettent d’observer plusieurs régions d’intérêt dans une configuration multipositions.

Optique supérieure

Des objectifs de qualité supérieure pour une large gamme d’applications est  l’une des caractéristiques de Leica Microsystems. Le cœur de notre  système de pivotement vertical de la feuille de lumière est réalisé par  les objectifs et le dispositif de miroirs TwinFlect.

Grâce à la gamme d’objectifs d’illumination, vous pouvez façonner la feuille de lumière en fonction des besoins de vos expériences.

Pour  révéler les moindres détails, avoir un champ de  vue plus large ; visualiser ou s’adapter à l’indice de réfraction de votre milieu d’imagerie, vous pouvez choisir l’objectif de détection optimal parmi un nombre croissant d’options.

Objectif Système d’imagerie de cellules vivantes Réactifs de nettoyage à base de sucre Compatible avec le clearing BAAB
FLUOTAR L 25x/0,95 W  Oui Non Non
APO L 20x/0,5 W Oui Non Non
Fluotar L 16x/0,6 IMM Oui Oui Oui
APO L 10x/0,3 Oui Oui Non
5x/0,15 IMM Oui Oui Oui

Gestion efficace des données

L’observation des processus en 3D et sur de longues périodes génère un grand volume de données. Plusieurs outils implémentés dans le logiciel LAS X vous aident à gérer facilement vos données. L’outil de fusion en ligne vous permet de conserver des données brutes ou de  gagner de l’espace disque en enregistrant uniquement l’image fusionnée. Vos données sont automatiquement sauvegardées durant l’acquisition. Le chargement intelligent facilite l’examen des données, ce qui vous donne un accès direct aux points temporels ou aux piles z qui présentent un intérêt pour les grands volumes de données. Vous pouvez compiler les étapes de post-traitement de votre choix dans un pipeline qui est automatiquement traité.

Conditions environnantes idéales

Une chambre thermostatée contrôlée par logiciel maintient les conditions environnantes idéales pour vos échantillons. Les utilisateurs ont un contrôle total des conditions expérimentales grâce au module de contrôle environnemental LAS X. Les données environnementales enregistrées peuvent être surveillées pendant l’expérience. Toutes les conditions environnementales peuvent être définies dans une seule interface. Vous pouvez donc, par exemple, exécuter des profils de température pour des expériences de choc thermique.

Choisissez entre une chambre environnementale ou des solutions d’incubation de type stage top.

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