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La prima tomografia crioelettronica integrata

Rivelare i meccanismi cellulari con una risoluzione sub-nanometrica in 3D

Per analizzare approfonditamente i meccanismi biologici complessi, i biologi necessitano di informazioni strutturali affidabili delle molecole target nel loro contesto subcellulare. Per questo motivo molecole target e ambiente cellulare devono essere risolti in modo accurato con una risoluzione sub-nanometrica. 

Dalla collaborazione tra Leica Microsystems e Thermo Fisher Scientific nasce una soluzione per crio-tomografia, in grado di rispondere alle esigenze di ricerca. Un trasferimento sicuro di dati e campioni  tra gli strumenti garantisce una facile navigazione nelle regioni cellulari target, nonché risultati affidabili a risoluzione sub-nanometrica.

Dipartimento di Biologia Strutturale Molecolare, Istituto Max Planck di Biochimica, Martinsried, Germania

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Prodotti Cryo Clem 3

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Leica EM Cryo CLEM montato su Leica DM6000 FS

EM Cryo CLEM

Correlazione di campioni biologici criofissati sul microscopio ottico ed elettronico

Congelatore ad alta pressione Leica EM ICE

Leica EM ICE

Congelatore ad alta pressione con possibilità di stimolazione luminosa

Flusso di lavoro tomografia crioelettronica

Fase 1: Vitrificazione

Le cellule analizzate vengono coltivate su una griglia per microscopia elettronica.

Prima del congelamento il campione viene mantenuto in una camera con condizioni di temperatura e umidità controllate.

Il campione viene quindi vitrificato con congelamento a immersione nell'EM GP2 automatico.

La vitrificazione inibisce la formazione di cristalli di ghiaccio, garantendo così che il contenuto cellulare mantenga il più possibile il suo stato originale.

Fase 2: Selezione

Per un flusso di lavoro efficiente è necessario preselezionare cellule e regioni target adatte, utilizzando il microscopio ottico Leica EM Cryo CLEM. Il campione viene quindi trasferito sul Thermo Scientific™ Aquilos™ per eseguire la fresatura. La piena connettività trag li strumenti fa in modo che le regioni e le coordinate definite vengano mantenute in modo sicuro e preciso durante il trasferimento all‘Aquilos. Basta sprecare tempo a localizzare la posizione target.

Per evitare di contaminare il campione prezioso, il flusso di lavoro integrato per criotomografia rende sicuro il trasferimento del campione tra i sistemi coinvolti. Lo specifico sistema a cartuccia protegge il campione lungo tutto il flusso di lavoro, ponendo le basi per risultati scientifici affidabili.

(Thermo Scientific, Krios e Aquilos sono marchi registrati di Thermo Fisher Scientific.)

Fase 3: Fresatura

Dopo aver eseguito la preselezione e il targeting nell'EM Cryo CLEM, il campione viene trasferito nel Thermo Scientific Aquilos, un microscopio elettronico Cryo DualBeam dedicato.

In passato era impossibile risolvere l’interno delle cellule con una risoluzione sub-nanometrica tramite tomografia crio-elettronica a causa del troppo elevato spessore dei campioni. 

Aquilos supera i limiti dati dallo spessore, utilizzando un fascio elettronico di scansione (SEM) e un fascio ionico focalizzato (FIB). Mentre il fascio elettronico è impiegato nell'imaging, il fascio di ioni gallio una precisa fresatura di cellule vitrificate. 

Nel processo di fresatura viene creata una sottile foglio di ghiaccio, la lamella su griglia, che può in seguito essere esaminata utilizzando la tomografia elettronica. 

Fase 4: Criotomografia 3D

La griglia EM che supporta le cellule e la lamella, viene poi trasferita dall'Aquilos al Thermo Scientific Krios™ G3i (Cryo TEM).

Il Cryo TEM realizza molteplici immagini dell’area di interesse, da diverse angolazioni, inclinando gradualmente il campione.

Le singole immagini vengono allineate computazionalmente e ricostruite per generare un tomogramma tridimensionale dalla lamella e il suo contenuto con una risoluzione sub-nanometrica.