Un microscopio ottico è spesso uno dei dispositivi principali in un laboratorio di ricerca nel campo delle scienze biologiche. Può essere usato per un'ampia gamma di applicazioni che mirano a dare una risposta a molti interrogativi scientifici. Pertanto, la configurazione e le caratteristiche del microscopio sono fondamentali per la sua copertura applicativa, che spazia dal campo chiaro all'imaging di cellule vive passando per la microscopia in fluorescenza.
Questo articolo fornisce una breve panoramica delle caratteristiche rilevanti di un microscopio e una sintesi degli aspetti principali da tenere in considerazione quando si seleziona un microscopio per la ricerca.
Quale tipo di campioni vengono usati?
Una delle prime cose da prendere in considerazione quando si seleziona un microscopio per la ricerca è il tipo di campione che si desidera analizzare. Per i campioni fissi montati su un sottile vetrino è possibile usare un microscopio verticale. Le cellule vive richiedono speciali caratteristiche del microscopio, perché vengono conservate in recipienti per la coltura di cellule relativamente grandi riempiti di apposito terreno di coltura.
Solo una configurazione invertita, con l'obiettivo sotto e il condensatore sopra il campione, consente di ottenere lo spazio libero essenziale e la necessaria vicinanza dell'obiettivo al campione. Contemporaneamente, un microscopio inverso mantiene una buona accessibilità alle celle, ad esempio per aggiungere micromanipolatori.
In quali dimensioni si deve lavorare?
I campioni per microscopio occupano tre dimensioni: lunghezza, larghezza e altezza. Mentre alcuni campioni come, ad esempio, le sezioni istologiche, vengono visualizzati solo in direzione x-y, altre applicazioni richiedono l'acquisizione anche nella dimensione z. Per acquisire immagini volumetriche in 3D, ad esempio di cellule vive, è consigliabile la presenza di un revolver motorizzato dell'obiettivo in grado di guidare passo passo il campione attraverso il fuoco. Il software di imaging dovrebbe essere in grado di ricostruire le singole immagini per la visualizzazione 3D.
Nel caso delle cellule vive, è necessario aggiungere la dimensione Tempo. In questo caso, ad esempio, la stabilità del sistema è un'altra caratteristica fondamentale. Poiché le variazioni di temperatura influenzano il sistema di imaging durante l'acquisizione, è essenziale adottare contromisure efficaci. Una regolazione automatica della messa a fuoco come la funzionalità AFC (Adaptive Focus Control, Controllo fuoco adattivo) contrasta queste influenze termiche e consente di trovare sempre la messa a fuoco predefinita.
Quale metodo di contrasto è più idoneo per i propri campioni?
La maggioranza delle cellule, soprattutto le cellule animali, esaminate con un microscopio non possiedono un sufficiente contrasto intrinseco che consenta di vedere i dettagli fini. I ricercatori usano metodo di contrasto per risolvere questo problema. Il contrasto di fase (PH) e il contrasto interferenziale differenziale (DIC) manipolano la luce che passa attraverso il campione per aggiungere contrasto, ma è anche possibile colorare il campione con tinte fluorescenti (immunofluorescenza) oppure usando proteine fluorescenti.
In base al metodo di contrasto usato, il microscopio necessita di una specifica apparecchiatura. Ad esempio, il contrasto di fase richiede obiettivi speciali, mentre il metodo DIC utilizza alcuni prismi che devono essere integrati nel percorso luminoso. Per la microscopia in fluorescenza occorrono speciali cubi portafiltri che consentono alle corrette lunghezze d'onda della luce di entrare e uscire dal campione.
Della sorgente di luce ne vogliamo parlare?
La scelta del metodo di contrasto determina anche la sorgente di luce. L'illuminazione per luce trasmessa per la microscopia convenzionale a campo chiaro, a contrasto di fase e DIC può essere eseguita per mezzo di un'illuminazione alogena o a LED. La microscopia in fluorescenza può essere eseguita con un'illuminazione a LED oppure con l'aiuto di lampade al mercurio, allo xeno o ad alogenuro metallico al mercurio.
Si desidera documentare o pubblicare i risultati?
Se si desidera acquisire un'immagine del proprio campione o eseguire l'imaging di cellule vive, è necessaria una fotocamera per microscopio digitale. Soprattutto in caso di imaging di cellule vive in fluorescenza, è consigliabile usare una fotocamera sensibile per ridurre al minimo la quantità di luce di eccitazione che può danneggiare le cellule. Oltre alle consolidate fotocamere CCD e EMDDC, oggigiorno hanno preso piede le fotocamere sCMOS, dotate di elevata efficienza quantica e velocità di acquisizione. Per ulteriori informazioni sulle fotocamere per microscopio digitale si prega di leggere l'articolo Introduzione alla tecnologia delle fotocamere digitali.
Inoltre, un ampio campo visivo (FOV, Field of View) aiuta a trovare più velocemente le aree di interesse e a visualizzare più cellule contemporaneamente. I moderni microscopi per la ricerca sono dotati di un FOV da 19 mm sulla porta della fotocamera che corrisponde perfettamente a un chip di fotocamera sCMOS da 19 mm.
Spesso non è sufficiente scattare semplicemente un'immagine del campione, ma devono anche essere analizzati i dati acquisiti. A tale scopo un software di imaging e analisi facile da usare aiuta a ottenere dati quantitativi e a eseguire valide analisi dei dati.
Si desidera manipolare le cellule nel microscopio?
Negli ultimi anni ha preso campo la fotomanipolazione dei campioni. Significa che i ricercatori non si limitano a osservare le cellule vive ma le manipolano con l'aiuto della luce. La funzionalità di ripristino fluorescenza dopo fotoimbianchimento (FRAP, Fluorescence Recovery After Photobleaching) è un esempio che aiuta a comprendere processi cellulari dinamici. Per questo tipo di tecniche di manipolazione sono spesso necessarie sorgenti di luce aggiuntive che devono essere integrate nel percorso luminoso del microscopio. Questo approccio è tutt'altro che banale. La soluzione universale Leica Infinity Port consente di integrare sorgenti di luce supplementari nel percorso luminoso del microscopio senza disturbare la qualità dell'immagine per eseguire applicazioni come, ad esempio, FRAP, fotocommutazione, ablazione oppure optogenetica. Con il corretto adattatore, i ricercatori possono addirittura integrare i propri dispositivi costruiti autonomamente.
Qual è il budget a disposizione?
Una domanda importante è quanti soldi si è disposti a spendere. alcuni fornitori di microscopi offrono configurazioni predefinite idonee per applicazioni speciali. Ma se non dovessero servire tutti i componenti preconfigurati per i quali si è costretti pagare? È per questo che una configurazione libera dei componenti può rivelarsi più conveniente dell'acquisto di un sistema di microscopio predefinito.
Inoltre, i requisiti di un microscopio possono variare nel tempo. In questo caso un sistema scalabile presenta dei vantaggi. Con una configurazione predefinita e fissa è possibile trovarsi costretti a usare una quantità limitata di applicazioni. La scalabilità offre la libertà di crescere man mano che cambiano le esigenze.
Tenendo bene a mente questi fattori, una piattaforma di microscopia modulare come Leica DMi8 consente ai ricercatori di iniziare con un sistema di microscopio a un prezzo accessibile che può essere successivamente ampliato e aggiornato in base alle esigenze.
Chi userà il microscopio?
La gamma di utenti di un microscopio può essere molto variegata. Soprattutto nelle università gli utenti possono essere persone molto esperte o principianti assoluti. Pertanto, un facile uso del sistema di microscopio gestito da un software intuitivo come Leica Application Suite X (LAS X), aiuta le persone a prendere velocemente confidenza con lo strumento e acquisire dati rapidamente. Ad esempio, una progettazione orientata al flusso di lavoro, procedure guidate per l'analisi delle immagini e un'integrazione di periferiche nel sistema senza ostacoli semplificano il lavoro.
Oltre ai microscopi per la ricerca a campo largo, nei laboratori di ricerca nel campo delle scienze biologiche vengono usati spesso anche microscopi stereo. Per ulteriori informazioni si prega di leggere l'articolo "Factors to Consider When Selecting a Stereo Microscope" (Fattori da prendere in considerazione nella selezione di un microscopio stereo).
