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Seguite le interazioni molecolari con la tecnica FLIM-FRET

La ricerca moderna studia il modo in cui le molecole interagiscono per svolgere compiti vitali. Studi biomedici di successo usano la tecnica FLIM-FRET per esplorare queste interazioni.

SP8 FALCON definisce un nuovo standard di velocità per gli strumenti FLIM. Consente di applicare il metodo FRET a eventi cellulari molto veloci. Potete acquisire e interpretare i dati FRET nei vostri esperimenti quotidiani.

Caged cAMP in cellule HeLa che esprimono FRET utilizzando la coppia di sensori EPAC mT2-dVenus. Risposta dell'EPAC all'uncaging del cAMP mediato dai raggi UV (area centrale). Filmato registrato a 4 fps. Dimensione immagine: 256 x 256 pixel. Scala dei colori (tempo di vita): ns. Per gentile concessione di Kees Jalink, Bram van den Broek, NKI Amsterdam.
Oscillazioni di calcio dopo una simulazione con reattività piastrinica indotta da TRAP. La risposta nelle singole cellule è registrata come cambiamento nel tempo di vita. Filmato acquisito a 4 fps. Dimensione immagine: 256 x 256 pixel. Scala dei colori (tempo di vita): ns. Per gentile concessione di Kees Jalink, Bram van den Broek, NKI Amsterdam.

Monitorate i cambiamenti rapidi e impercettibili utilizzando i biosensori

I biosensori rilevano efficacemente l'attività metabolica, segnalando cambiamenti microambientali, nei meccanismi e nel PH.

SP8 FALCON consente di accedere a queste informazioni contenute nel tempo di vita della fluorescenza, anche di eventi ultra veloci come la potenziale dinamica della membrana. Tali informazioni integrano l'imaging spettrale,già potente di suo, offerto dalla piattaforma SP8.

Imaging metabolico più affidabile e sensibile

L'autofluorescenza è un comune problema nell'imaging convenzionale. SP8 FALCON la trasforma in informazioni preziose. Adesso potete trasformare l'autofluorescenza in un rapporto sullo stato metabolico, sulla differenziazione cellulare e sullo sviluppo del cancro.

Inoltre il sistema SP8 FALCON consente il contrasto nei tessuti vivi per l'imaging laddove la marcatura in fluorescenza è spesso poco specifica oppure distrugge le condizioni fisiologiche.

Autofluorescenza nelle cellule di mammiferi in condizioni non fisiologiche (pH 8,5). Il segnale si correla a cambiamenti nel pool endogeno di NAD/NADH. Lo sviluppo di stress ossidativo si legge come una riduzione del tempo di vita della fluorescenza nel tempo. Dimensione immagine originale: 512 x 512 pixel. Scala dei colori (tempo di vita): ns. Acquisizione di immagine a due fotoni eseguita con SP8 DIVE e SP8 FALCON.
Intensity
FLIM

Separazione del fluorocromo oltre la classica separazione spettrale

La marcatura a fluorescenza è il modo standard per differenziare le strutture intracellulari. La separazione spettrale è molto potente, ma a volte è limitata quando gli spettri di emissione sono troppo vicini.

Con SP8 FALCON è possibile superare questo limite usando la dimensione aggiuntiva del tempo di vita della fluorescenza. In tal modo si possono utilizzare più sonde a fluorescenza nello stesso range spettrale (purché abbiano tempi di vita diversi).

Maggiori vantaggi combinando le opzioni della piattaforma SP8. Tali opzioni includono la sorgente di eccitazione laser a luce bianca, l’AOBS (acousto-optical beam splitter) e la detection spettrale multicanale.
 

Immagine: Strutture di citoscheletro evidenziate dal contrasto basato sul tempo di vita. Vimentina immuno-etichettata con Alexa Fluor 555 (verde) e tubulina immuno-etichettata con Alexa Fluor 546 (blu). I fluorocromi sono spettralmente molto simili, ma vengono separati usando le informazioni fornite dal tempo di vita della fluorescenza. Dimensione immagine: 512 x 512 pixel.

SP8 FALCON Imaging deriva da FAst Lifetime CONtrast

Il microscopio SP8 FALCON supera i limiti del FLIM in termini di velocità e apre le porte allo studio di tempi di vita brevi.

Finora le informazioni funzionali ricavate dai tempi di vita di fluorescenza relativi a processi rapidi erano difficili da ottenere a causa dei limiti tecnici del FLIM. La velocità di acquisizione FLIM era di 10 volte inferiore rispetto all’acquisizione dell’ intensità confocale.

Con SP8 FALCON, tramite imaging di contrasto basato su tempi di vita anche brevi, è possibile seguire processi dinamici nella cellula a velocità adeguata. Ciò è possibile grazie ad un nuovo metodo di misura del tempo di vita mediante TCSPC (Time-Correlated Single Photon Counting) unitamente ad algoritmi intelligenti per gestione e analisi dei dati.

Immagine a singolo canale di perle fluorescenti (magenta) in una soluzione contenente Alexa Fluor 555 (verde). La separazione del fluorocromo basata sul tempo di vita di fluorescenza può essere effettuata a velocità diverse, per esempio 16 fps (top), 27 fps (video-rate, centrale), e 83 fps (ultra-rapido, in basso). Utilizzare i tempi di vita per la separazione dei fluorocromi è notevolmente più vantaggioso rispetto all’utilizzo delle intensità (scala di grigi). I video mostrano il fitting pixel-per-pixel delle componenti dei tempi di vita. Misura dei frame: 512 x 64 pixel. Barra di scala: 10 µm.
Acquisizione diretta di campioni complessi. Immagine a mosaico di embrione di topo ad alta risoluzione con 722 riquadri contenenti 190 megapixel. Dati FLIM dotati di quattro tempi di vita della fluorescenza caratteristici con codifica del colore. Acquisizione: 1:23 h. Analisi: 1:00 h

Imaging multimodale

La combinazione della tecnica FLIM con altre modalità non è mai stata tanto facile come con SP8 FALCON. Fino ad ora i sistemi FLIM presentavano complessi cablaggi ed erano necessarie complicate procedure di trasferimento dei file. Con SP8 FALCON è possibile integrare le informazioni fornite dal tempo di vita nel flusso di lavoro confocale standard.

Il sistema SP8 FALCON è completamente integrato nel software di acquisizione e analisi LAS X. Può registrare immagini FLIM su quattro canali spettrali simultaneamente e fino a 10 canali sequenzialmente. SP8 FALCON consente l'accesso al contrasto basato sul tempo di vita in stack 3D, sequenze in time-lapse e anche in grandi formati di immagini a mosaico.

Con il nuovo LAS X NAVIGATOR potete espandere fino a 10.000 volte la vostra area di visualizzazione, per risparmiare tempo prezioso durante l'identificazione delle vostre regioni di interesse e l'esplorazione dei vostri campioni in un modo completamente nuovo.

Analisi diretta dei tempi di vita mediante i fasori

L’analisi effettuata con SP8 FALCON mediante fasori FLIM fornisce una visualizzazione 2D dei componenti del ciclo di vita.

Con i fasori FLIM è possibile seguire i cambiamenti microambientali, separare le componenti all'interno di un multiplex e determinare l'efficienza FRET.

Il fasore FLIM consente di migliorare la risoluzione delle immagini STED. È possibile ottenere la stessa risoluzione con meno potenza di deplezione STED (Lanzanò et al., Nature 2015).

Le cellule sono marcate con Alexa555-Phalloidin e H2B mCherry. La separazione viene eseguita mediante i fasori FLIM. Il grafico del fasore mostra chiaramente due contributi. Per gentile concessione di: Dott. Martin Stöckl, Dipartimento di Biologia, Università di Costanza, Germania.

I risultati che vi servono, con un solo clic

Il software LAS X consente di impiegare la tecnologia FLIM con pochi clic del mouse e la stessa filosofia che caratterizza l'imaging spettrale di routine.

Anche se usate la microscopia come tecnica complementare, potete trovare gli elementi essenziali e avviare immediatamente l'imaging.

Funzioni più specializzate sono accessibili come flussi di lavoro e consentono il massimo livello di automazione nell’acquisizione.

1 solo clic per concentrarvi sul vostro campo di ricerca: SP8 FALCON controllato dal software LAS X

Studiare la dinamica molecolare con SP8 FCS

Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) è una tecnica quantitativa utilizzata in microscopia. Si utilizza per studiare la concentrazione delle particelle, il coefficiente di diffusione, la viscosità, la massa molecolare, la costante di legame e le proprietà foto-fisiche basandosi sulle fluttuazioni dell’intensità.

La combinazione di FCS e FLIM consente di eseguire esperimenti di Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy (FLCS). La FLCS viene utilizzata per lo studio dell'interazione di molecole che non sono separabili spettralmente e per eliminare il contributo del rumore di fondo.

Lo STED diminuisce il volume focale. Per questo motivo, la FCS STED fornisce informazioni molecolari anche ad intervalli di concentrazione elevati (>100 nM), nei quali la FCS confocale va incontro ai suoi limiti.

Immagine in alto: Tracciati di intensità e curve di autocorrelazione per diverse concentrazione di Atto488, l'ampiezza diminuisce aumentando la concentrazione. Immagine in basso: il volume di eccitazione in confocale (a sinistra) e STED 3D (a destra). Il volume minore nel caso di STED consente la misurazione delle fluttuazioni a concentrazione molecolare superiore.

Feedback degli esperti

"Abbiamo analizzato attentamente il sistema Leica SP8 FALCON. È preciso in ogni suo aspetto come le soluzioni TCSPC dedicate; in più è dotato di un'interfaccia intuitiva e una velocità turbo." "A mio parere questa è una svolta rivoluzionaria nel campo dell'imaging funzionale." - Prof. Kees Jalink, Ph. D., Netherlands Cancer Institute (NKI), Amsterdam." - Prof. Kees Jalink, Ph. D., Netherlands Cancer Institute, Amsterdam

"La nuova soluzione FLIM/ FCS di Leica darà un forte impulso alla loro applicabilità: eccezionalmente veloce, flessibile e semplice da usare."Prof Christian Eggeling, Università di Oxford

"La maggior parte degli strumenti FLIM sono accessori accoppiati al microscopio, questo è un cambiamento completo di prospettiva: un sistema veramente integrato, potentissimo!" - Prof. Enrico Gratton, UCI Samueli, Università della California, Irvine

"Leica SP8 FALCON è il primo sistema commerciale che offre l'integrazione dell'imaging confocale e di quello basato sul tempo di vita della fluorescenza e che posso pensare di usare in una core facility." - Provost Prof. Scott E. Fraser, Ph. D., Università Southern California, Los Angeles

In alto: versatile piattaforma SP8 (a sinistra), nanoscopia (al centro), super risoluzione (a destra)
In basso: spettroscopia CARS (a sinistra), microscopia a foglio di luce (al centro), spettroscopia multifotone (a destra)

Nella famiglia di prodotti TCS SP8

Il sistema SP8 FALCON è il più recente setup che si aggiunge alla consolidata piattaforma SP8 di Leica Microsystems. La piattaforma può essere configurata per adeguarsi a diversi metodi di ricerca, dalla microscopia confocale con super risoluzione alla nanoscopia STED.

Per gli utenti questo si traduce in versatilità e protezione dell'investimento.

Tutti gli strumenti della piattaforma SP8 sono aperti e adattabili alla ricerca dell'utente, adesso e in futuro.