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初の統合型クライオ電子線トモグラフィ

サブナノメートルの解像度で、三次元で細胞メカニズムを明らかにする

複雑な生物学的メカニズムを明らかにするために、ライフサイエンスの研究者は、細胞内のターゲット分子に関する信頼できる構造情報を必要とします。このためにターゲット分子とその細胞環境は、サブナノメートルの解像度で正確に解像する必要があります。 

ライカ マイクロシステムズと Thermo Fisher Scientific 社が連携し、これらの研究ニーズに対応する統合型のクライオ電子線トモグラフィ ワークフローを実現しました。装置間で安全に試料を搬送・データ転送できることで、 細胞のターゲット領域を容易に捉え、サブナノメートルの分解能で信頼性の高い結果が得られます。

Department of Molecular Structural Biology, Max Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Germany

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Cryo CLEM 製品 5

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ライカ正立デジタル顕微鏡 DM6 FS を組み合わせたライカ EM Cryo CLEM システム

EM Cryo CLEM

光電子相関顕微鏡(CLEM)システム

高圧凍結装置 ライカEM ICE

Leica EM ICE

オプションの光刺激および電気刺激機能付き高圧凍結装置

クライオ電子線トモグラフィ ワークフロー

ステップ 1:ガラス状(非晶質)凍結

研究対象の細胞を電子顕微鏡用グリッド上に培養します。

凍結前の試料は安定した温度で湿度を制御する環境チャンバー内に維持されます。

その後、試料は自動浸漬凍結装置 EM GP2 を用いた浸漬凍結によってガラス状に凍結します。

ガラス状凍結プロセスにより氷晶形成が抑制され、細胞構造をできるだけ本来の状態に近い状態に保ちます。

ステップ 2:選択

効率的なワークフローを実現するために、適切な細胞とターゲット領域をあらかじめ選択する必要があります。これはクライオ光学顕微鏡 ライカ EM Cryo CLEM を使用して行うことができます。その後試料は、ミリングのために Thermo Scientific™ Aquilos™ に搬送されます。装置間での完全な接続性が確保されていることで、定義された領域と座標が安全・正確に送られ、Aquilos による迅速な位置決めを可能にします。ターゲット位置を探すのに時間を費やす必要がありません。

貴重な試料のコンタミを防ぐために、統合型のクライオ電子線トモグラフィ ワークフローによって関与するシステム間での試料の安全な搬送が確保されます。専用のカートリッジシステムが、ワークフロー全体を通して試料を守り、信頼性の高い研究結果を得るための確かな基盤を提供します。

(Thermo Scientific、Krios および Aquilos は、Thermo Fisher Scientific 社の登録商標です。)

ステップ 3:ミリング

EM Cryo CLEM による凍結グリッドの選別とターゲット領域の選択の後、試料は専用のクライオデュアルビーム電子顕微鏡 Thermo Scientific Aquilos に搬送されます。

かつては、多くの試料がクライオ電子線トモグラフィを用いてイメージングするには厚すぎたため、サブナノメートルの解像度で細胞内部を解像するのは不可能でした。 

Aquilos は、走査電子ビーム (SEM) と集束イオンビーム (FIB) を利用することでこの厚さ限界を克服しました。電子ビームをイメージングのために利用する一方、ガリウムイオンのビームはガラス状に凍結した細胞を正確にミリングするのに使用されます。 

ミリングプロセスによって、凍結薄片(グリッド上のラメラ)が生成され、電子線トモグラフィを用いて観察することができます。 

ステップ 4:三次元クライオトモグラフィ

グリッド上のラメラを含む、細胞を支持する TEM グリッドは、Aquilos から Thermo Scientific Krios™ G3i (クライオ TEM) へと搬送されます。

クライオ TEM により、試料を徐々に傾斜させて様々な角度から複数回、観察領域のイメージングを行います。

それらの画像が計算に基づき位置合わせ・再構成されて、ラメラとその構造からサブナノメートル解像度での三次元の断層像が生成されます。

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