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SP8 DIVE Leica Leica Microsystems
Confetti マウスの小腸。細胞系譜トレーサー。シアン:CFP、緑:GFP、黄:YFP、赤:RFP。結腸がん研究。画像提供:Jacco van Rheenen, University of Utrecht, the Netherlands(ジャッコ・ファン・レーネン教授、オランダ・ユトレヒト大学)。

4Tune がもたらすスペクトル調整の自由

トランスジェニックマーカーの数は急増する一方です。しかし SP8 DIVE は、マーカーの種類の増加をまったく苦にしません。マウスを数回クリックするだけで既存の、そして新規のトランスジェニックマーカーに対応することができます。

スペクトルの自在な調整は、非デスキャン型検出に適した新しい画期的な 4Tune 技術によって実現しました。4Tune 検出器はすべての蛍光に適応し、大きく重なるスペクトル同士を分離できます。ソフトウェア処理は必要ありません。

SP8 DIVE では、従来の 2 倍の蛍光シグナルを取得できます。それにより、より深部での観察とイメージング速度が向上し、生体内イメージング中の光毒性を弱めることができます。

 

「従来のダイクロイックミラーではすべての蛍光色素分子を判別することができませんでした。DIVE のスペクトル検出器なら、検出したいそれぞれの蛍光色素分子に合わせて波長を最適化できるので、とても簡単に、すべての蛍光色素分子を判別することができるようになりました。」

Prof. Dr. Jacco van Rheenen. University of Utrecht, the Netherlands(ジャッコ・ファン・レーネン教授、オランダ・ユトレヒト大学) 

Alberto Diaspro

Istituto Italiano di Tecnologia (IIT), Genua(イタリア技術財団(ITT)、ジェノバ)

“今日、マルチフォトン顕微鏡法のさらなる認知拡大、普及において非常に重要な製品です。アプリケーションの幅が広がったことは大きな飛躍であり、様々な試料に関連する多くの問題を解決することができます。注目すべきは、第二高調波(SHG)と 2 光子イメージングが効果的に統合されている点で、

STED モジュールや他のライカ製品と組み合わせれば、空間分解能や時間分解能、また将来開発される蛍光試薬を使った観察など、さまざまなニーズに対応させることが出来ると思います。 

2 光子励起照明ビームを拡大・収縮させて、後焦点面の状態を制御・可視化できるかもしれないというのは素晴らしいですね。とても気に入りました。”

Sophie Allart

Ingénieur de Recherche
INSERM, Centre de physiopathologie de Toulouse Purpan(フランス国立保健医学研究機構(INSERM)、ツールーズ・プルパン生理病理学センター、研究技師)

“機能がモジュール化されている点に驚きました。NDD 検出器の前でフィルターキューブを使用することは、蛍光色素の選択に影響するため、時に試料調整や蛍光色素を変更しなければなりません。これからは間違いなく作業の手間が省けます。

もちろん、性能的にも素晴らしい。これまで 10 年ほど 2 光子での観察を行ってきましたので、4 色で見るというのは非常に興味深いです。”

Kees Jalink

Netherlands Cancer Institute(オランダがん研究所)

"デモンストレーションを受けたところなのですが、じつに衝撃的でした。これまで可視光で観察してきたものを、今度は赤外線で観察できるとは、本当に驚きです。素晴らしいですね。"

Ron Hoebe

LCAM, van Leeuwenhoek Centre for Advanced Microscopy, University Amsterdam(ファン・レーウェンフック高度顕微鏡法センター(LCAM)、オランダ・アムステルダム大学)

“新しい 2 光子スペクトル検出器がお気に入りです。検出器の制御がソフトウェアに組み込まれている点が非常に気に入っています。

私はイメージングセンターを統括してしているので、操作性を何より重視しています。センターには、200 名以上のスタッフがおり、操作方法が複雑な装置では、トレーニングに時間がかかってしまうからです。

より簡単で、直観的な製品であるほど良いと思います。”

Ammasi Periasami

W.M. Keck Center for Cellular Imaging, VA(W.M. ケック細胞イメージングセンター、米国バージニア州)

“波長設定 740 ~ 920 が好みです。蛍光試薬に合わせて使用する波長を選択しなければならない場合に最適な設定です。 ひとつの波長を使用し、2~3 個の検出器を組み合わせて調整すれば、多くの選択肢を得られます。

SN 比と、蛍光検出側の柔軟性も素晴らしいです。

ユーザーフレンドリーで使いやすいシステムであることは、非常に重要です。私はその点を最も重要視しています。ライカなら、2 光子での観察でも、1 光子の際と変わらず操作が簡単です。"

[2017 年の顕微鏡技術国際コンファレンス FOM(Focus on Microscopy)で行ったデモンストレーション中に、IR レーザー 1 台とスペクトル HyD-NDD 検出器 2 個を装着した SP8 DIVE を使い、4 つの標識のデータが得られました。励起波長 740 nm(杯細胞の粘液用に Alexa Fluor® 350、細胞核用に Sytox® Green)励起波長 920 nm(コラーゲン用に二次高調波、F アクチン用に Alexa Fluor® 568 ファロイジン)] 

Marc van Zandvoort

Maastricht University, Genetics and Cell Biology(マーストリヒト大学、遺伝学・細胞生物学)

“とても良い拡張機能だと思います。これまでの 2 光子システムよりも、検出器を使用した際のシステムの柔軟性が高まります。

検出器の使用には、専用フィルターが必要で、活用範囲はとても限られていましたが、 その幅が広がるという点で、非常に良い拡張機能だと思います。”

Urs Ziegler

Head of Facility, Center for Microscopy and Image Analysis, University of Zurich(チューリッヒ大学顕微鏡法・画像解析センター施設長)

"とてもフレキシブルで使いやすいです。フィルターを自分で交換する必要はありませんし、考え得るすべての蛍光色素を使用することができます。

とてもありがたいのは、基本的に、共焦点レーザー顕微鏡を知っているユーザーであればトレーニングをする必要がないことです。フィルターを自分で交換する必要はありません。これまで可能ではあるとはいえ、決して容易ではなかった、フィルターと蛍光色素の異なる組み合わせをDIVEはいとも簡単にクリアします。

そしてもちろん、生きた生体組織において様々な蛍光試薬を使用することや、第二高調波、第三高調波の使用も、SP8 DIVEを使うことで驚くほど簡単にできます。たいへん大きな革新であると思います。"

DIVE で容易に – 4Tune 検出器

4Tune 非デスキャン型検出器は、2~4 個の検出ユニットを搭載できるほか、ハイブリッドディテクター(HyD)または光電子増倍管(PMT)、もしくはその両方と組み合わせて自由に構成できます。捉えた蛍光を可変ダイクロイックミラーと可変バンドパスフィルターで分離します。380 nm から 800 nm までの波長域で調整が可能です。

4Tune には、複数のトランスジェニックマーカーの蛍光取得設定をドラッグ&ドロップ操作で簡単に最適化できるユーザーインターフェイスが用意されています。わかりやすい直観的デザインのため、操作は簡単で、習熟に必要なトレーニングは最小限で済みます。

SP8 DIVE は、既存のもの、新たに開発されるものを含め、あらゆるトランスジェニックマーカーに対応でき、陳腐化することがありません。

上: 急速に増え続けるマーカー数
下: 4Tune ユーザーインターフェイス
マウスの脚。Rab5-GFP で標識した筋繊維。IRAPO 40x 1.1。左:解像度を最大化。右:深部観察を優先。深部観察設定を使用すると、蛍光輝度がほぼ 2 倍に上がります。その結果、より深部の観察が可能になります。画像提供:Prof. Rudolf, University of Applied Science, Mannheim(ルドルフ教授、マンハイム応用科学大学)。

新たな次元で深部を探る

SP8 DIVE では、機能の調整によって極深部や詳細な細部の情報を取り出すことができます。新たに搭載された可変ビームエクスパンダー(VBE)により、使用する対物レンズに合わせてすべての励起ビームを個別に、最適に調整できます。

この VBE により、最適なコローカリゼーションが可能となり、研究課題に合わせて解像度と深度のバランスを適切に設定することができます。

可変ビームエクスパンダー(VBE)による深度と解像度の最適化

ライカの可変ビームエクスパンダー(VBE)では、ビーム径と角度を調整できます。それにより、最大の深度、最適な解像度が得られ、すべての波長域での補正が行われます。

ビーム径を調整し、解像度と深度のバランスを最適化(上の画像)

ビーム径の調整によって、解像度と入射エネルギーの最善のバランスを個別に選択できます。ビーム径を大きくすると、対物レンズ後焦点面において均一なビーム照射が得られます。開口数の高い対物レンズと組み合わせることで、解像度が最大となります。

ビーム径を小さくすると、フォーカルボリュームへの照射エネルギーが増え、試料内部への浸透が向上し、より深部でのイメージング結果が得られます。VBE では、最大 4 つの波長の異なる IR(赤外線)ビームを個別に調整し、解像度と深度の最適バランスを調整することができます。

ビーム角度を調整し、フルカラー補正(下の画像)

入射角度の調整により、IR の波長によって異なる軸上色収差を補正します。これにより、試料の同一焦点面を、最大 4 種類の波長の赤外光で励起できます。

可変ビームエクスパンダー(VBE)
マウスの脛骨。横紋筋。神経筋接合部発生過程の形態学的解析。緑:GFP – Rab 5(GTPase、エンドゾーム)。赤:mCherry – Bif 1。灰色:AF647- α ブンガロトキシン(NMJ)。画像提供:Prof. Rudolf, University of Applied Science, Mannheim(ルドルフ教授、マンハイム応用科学大学)。

マルチカラーの深部生体内イメージングで再現性のある結果

マルチカラー励起1回の実験で複数種のトランスジェニックマーカーを励起するとともに、完璧な波長分離を実現します。あるいは、回折限界ボリューム内で、局所的な高精度なフォトマニピュレーションと同時イメージングが可能です。SP8 DIVE は最大 3 つの調整可能な励起ラインを同時に装備でき、出力調整は音響光学素子によって行います。レーザーの波長は最高 1300 nm まで対応できるため、マルチフォトン実験で赤および遠赤の色素を使用することもできます。散乱が少ないため、深部にまでレーザーが届き、深部から詳細情報をふんだんに含むイメージが得られます。

TuneIR – 装置の状態を常に最適に維持し、重要な情報を探り出す常に正確な結果を得るうえで、装置と IR ビームを信頼性が高く、安定した状態に保つことが絶対の条件となります。そこでライカは、可変ビームエクスパンダー(VBE)に斬新なビームキャッチャーユニットを組み合わせました。これにより、最大 3 本の調整可能な励起ラインについて、再現性と最適なイメージング条件、そして複数のマーカーの最適なコローカリゼーションを保証します。

汎用性とアップグレーダビリティ

SP8 DIVE のベースは、汎用性の高さで定評のある SP8 プラットフォームです。超解像共焦点顕微鏡から STED ナノ顕微鏡に至るまで、SP8 シリーズのすべてのラインナップを DIVE と組み合わせることができます。

研究の進展に合わせて今すぐに、また将来にも、プラットフォームは必要に応じていつでも拡張することができます。

上: 汎用性の高い SP8 プラットフォーム (左), ナノスコピー (中),超解像 (右)
下: CARS (左), ライトシート (中), SMD (右)