Leica TCS SP8 DLS Leica Leica Microsystems

The Vertical Turn

ライトシートと共焦点顕微鏡のコンビネーション Leica TCS SP8 DLS

2 つの専用イメージングシステムを統合することで得られる利点：ライカ TCS SP8 DLS (デジタルライトシート) では、共焦点のフル機能と、試料に優しいシート照明を 1 台の顕微鏡にまとめました。新開発の TwinFlect ミラーにより、ライカ TCS SP8 共焦点プラットフォームが、操作の容易な多用途ライトシート顕微鏡に変わります。

選択肢の拡張

シート照明により細胞生存率が向上します。

sCMOS カメラで高速生体プロセスの観察が可能になります。

試料の取り扱いが容易でマルチポジション実験が可能です。

共焦点法とライトシート顕微鏡法との組み合わせにより新しいアプリケーション分野が拓けます。

試料を左右両側から照明することで、陰影の発生を抑制します。

ライカ TCS SP8 が提供する世界をフル活用して、常に最適なイメージング法で試料を観察できます。

お手元の共焦点をライトシート装置にしませんか。ライカ TCS SP8 は、いつでもライカ TCS SP8 DLS にアップグレードできます。

The Vertical Turn – ライトシートを共焦点顕微鏡に搭載するには

ライトシート顕微鏡では通常、独立したシステム上で専用の光学系をセットアップし、照明用対物レンズと検出用対物レンズを互いに直交するように配置することが必要です。ライカ TCS SP8 DLS では、ライトシート顕微鏡法がこれまで考えられなかったほど簡単になります。ユニークな TwinFlect ミラーデバイスで照明のライトシートを 90° 曲げることで、照明光と検出光の光路をライカ TCS SP8 倒立顕微鏡の垂直軸に統合します。これによって共焦点機能が妨げられることはありません。

長時間の観察と記録作成

イメージングには光が必要ですが、光が強すぎると細胞を傷めることがあります。ライトシート顕微鏡法は、現時点で試料への刺激が最も少ないイメージング手法で、光毒性やブリーチングによる全体的な光損傷を低減することができます。これにより試料の生存率は必然的に向上します。ライトシートイメージングは特に、発生生物学で有利な方法です。低出力照明と画像の高速取得の組み合わせにより、ショウジョウバエの胚のような、感受性の高い組織の発生過程を長時間にわたって観察し、組織と器官が形成される様子をリアルタイムで、3D 画像を使って理解することができます。

Low phototoxicity and specimen imaging in 3D: Development of Drosophila melanogaster over six hours. Probe: Light-sensitive RFP. 3D rendering. 150 µm z stack, 30sec/stack.

ライトシートイメージングの原理
ゼブラフィッシュの側線の発生

ライトシートイメージングの原理

ライトシート顕微鏡法は、試料を 1 枚のシート状に照明することで、感受性の高い試料や速い生体内プロセスを、試料を傷めずに観察する方法です。焦点外での励起がないため、光毒作用の発生は焦点面のみに限られます。またこの方法は自動的に光学セクショニングを行うことでもあり、ライトシートを横切る方向に試料を動かすことで試料の 3D イメージングが可能です。

長時間の多色観察

17 hours of zebrafish lateral line development. Zebrafish 36hpf, CldnB:lynGFP / Cxcr4B:nuclearRFP. Sample courtesy of Darren Gilmour, EMBL Heidelberg, Germany.

High speed imaging: Beating zebrafish heart, transgenic line flik1::EGFP. Post-acquistion alighment after xytz recording. Recording speed: 120 frames/second. Courtesy of Emily Steed, Vermot Lab, IGBMC Strasbourg, France.

高解像度の画像を高速取得

急速で周期的な生物学的過程を長時間にわたって三次元で観察することをお望みですか。それならば DLS モジュールが正しい選択です。ゼブラフィッシュの心臓拍動の素晴らしさを発見できます。

ライカ TCS SP8 DLS には、高解像度の画像を高速で取得できる、最先端のsCMOS カメラ 2 機種が用意されています。pco.edge sCMOS カメラと浜松ホトニクス社製の ORCA-flash 4.0 V2 は、ともに LAS X LightSheet ウィザードに完全に統合されています。

急速な周期運動の追跡

LAS X ソフトウェアの新しい xytz スキャンモードにより、単一平面の時系列画像が得られ、これらを融合して 4D 動画を作成することができます。これによって、従来の Z スタックのタイムラプス記録では追随できないような高速の周期運動、たとえばゼブラフィッシュの心臓の拍動を追跡することが可能になります。

Combining imaging modes: Photoconversion (405 nm laser) and wounding (multiphoton laser) in Kaede zebrafish tail. Time lapse recording of photoconverted cell (small red) migrating towards the wound (large red area)

数多くのアプリケーションでさまざまな利点

ライカのライトシートモジュールは、共焦点顕微鏡の単なるアドオン機能ではありません。ライカ TCS SP8 とデジタルライトシートを組み合わせることで、選択肢が大きく広がります。LAS X ソフトウェアで共焦点モードとライトシートモードを簡単に切り替えられるため、共焦点法で試料をスキャンすることもできます。光変換または創傷実験をおこなったあとの試料への刺激の少ない条件下での長期観察も簡単に行うことができます。

マクロファージによる創傷の治癒

Macrophages in the tail of a 4 day old Zebrafish embryo after wounding (mpeg1:Kaede). Sample courtesy of Francesca Peri, EMBL Heidelberg.

常に適切なレーザー

ライカ TCS SP8 共焦点顕微鏡の可視光レーザーはすべてライトシートイメージングに利用できます。ライトシート実験に最適の蛍光色素を選ぶ上で自由度が最も高いのは白色光レーザーです。白色光レーザーを使えば、多色実験でスペクトル的に近接した蛍光試薬を用いることも可能になります。

試料調製は手慣れた方法で

ライカ TCS SP8 DLS ではセットアップが垂直なので、試料はいつもの手慣れた方法で調製できます。試料は通常のガラスボトムディッシュにマウントできるため、直接アクセスすることができます。マルチポジション実験で複数の試料をスクリーニングできます。共焦点用の電動ステージを使って、複数の試料を 1 回の実験セットアップでイメージングすることも不可能ではありません。必要な前提条件はといえば、試料の両側に TwinFlect ミラーを配置するため、多少のスペースを確保することだけです。

Sample preparation for Leica TCS SP8 DLS. Specimens are embedded in agar on glass bottom petri dishes. Excessive agar has to be removed to make room for the TwinFlect mirror.

ユーザーのニーズに焦点を合わせる

ワークフローに沿ったソフトウェア設計

データ記録および評価のために、顕微鏡用ソフトウェア LAS X が手順を追ってユーザーをガイドします。ワークフローに沿った設計がなされているため、操作が一層効率的にできます。ライトシートを正確に設定するために便利なキャリブレーションウィザードが用意されています。

試料を左右両側から照明することが、この場合の基本です。対向関係にある TwinFlect ミラーのそれぞれの向きをスキャナーで調整し、陰影ができないようにします。広い視野で鮮明な画像を得るために、LAS X ソフトウェアの LightSheet ウィザードでオンラインまたはオフラインでマージオプションを使い、2 つの画像をマージできます。

さらにソフトウェアパッケージを追加することで、LAS X をニーズに合うようにカスタマイズすることもできます。LAS X 3D Visualizationモジュールでは、三次元データを斬新な方法で取り扱い、直観的なクリッピング、高速レンダリング、立体表示が可能です。タイリング実験では広視野の観察が、Mark & Find 実験ではマルチポジションセットアップによる複数の関心領域の観察が可能です。

卓越した光学系

広範な用途に対応する優れた対物レンズはライカマイクロシステムズの特徴の一つです。ライトシートを垂直に旋回させるシステムのコアは、対物レンズと TwinFlect ミラーで構成されています。照明用対物レンズとしてライカ HC PL Fluotar 2.5x/0.07 とライカ HCX PL FLUOTAR 5x/0.15 が用意され、そのいずれかを選ぶことで、実験条件に適した形状のライトシートが得られます。検出用対物レンズとしては、細部を観察するか広い視野を望むかによって、ライカ HC FLUOTAR L 25x/0.95 W とライカ HC APO L 10x/0.3 W 水浸対物レンズのいずれかを選択できます。

大量のデータを簡単に処理

3D 観察や長時間観察では大量のデータが取得されます。このようなデータを扱うには、LAS X ソフトウェアに組み込まれている各種ツールを利用するのが便利です。オンラインマージツールでは、RAW データを保持することも、ハードディスク容量の節約のためマージ画像のみを保存することもできます。データは取得中に自動的に保存され、スマートローディング機能により大量のタイムラプスデータセットの中から希望するタイムポイントあるいは Z スタックに直接アクセスできるので、データの見直しが容易にできます。また希望する後処理プロセスステップをパイプラインに組み込み、自動処理することが可能です。

ソフトウェア制御の恒温チャンバー

ソフトウェア制御の恒温チャンバーにより、試料に最も適した環境条件が維持されます。LAS X の環境制御モジュールにより、実験条件の完全なコントロールが可能です。環境データはログに記録され、実験中に監視することもできます。単一のインターフェース内ですべての環境条件を設定でき、たとえばヒートショック実験を所定の温度プロファイルに従って行うことができます。