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PAULA가 어떻게 상처 치유(wound healing) 분석 워크플로우를 간소화할 수 있을까요?

상처 치유 분석(wound healing assay)은 스크래치 분석 또는 이동 분석의 동의어로도 자주 불리며, 단일 세포 또는 세포 개체군의 이동 평가 및 측정에 중요한 도구입니다. 세포 이동은 발생 과정 동안 엄격히 통제되지만 때때로 암 발생 및 진행으로 인해 통제를 벗어날 수 있습니다.

세포 이동과 관련된 중요한 질문은 다음과 같습니다.

  • 특정 약물이 세포의 이동 속도를 어떻게 변화시키는가?
  • 특정 조건에서 세포가 얼마나 빨리 이동하는가?

상처 치유(wound healing) 실험

상처 치유 실험을 수행하는 기본 절차는 상당히 명확합니다. 100% 채워진 세포 단층에 인위적으로 세포가 없도록 간극을 만든 다음 이 간극을 닫는 세포의 능력을 모니터링합니다.

신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 얻으려면 수많은 매개변수를 고려하고 표준화해야 합니다. 다음 섹션에서 세포 모니터링에 관한 몇 가지 일반적인 측면을 다루면서 PAULA가 워크플로우 작업을 단순화하는 데 어떤 도움을 주는지 알아봅니다.

적절한 컨트라스트 방법

표준 명시야(Brightfield) 현미경 설정에서 대부분의 세포 단층은 비교적 탐지하기 어렵고 심지어 "보이지 않기도 합니다". 위상차(phase contrast)를 사용하면 세포 "모양"이 강조되어 세포를 쉽게 찾을 수 있습니다. 그러나 수동 현미경에서 위상차를 사용하도록 설정하는 것은 특히 숙련되지 않은 사용자에게는 번거롭고 시간이 오래 걸리는 작업일 수 있습니다. 일반적으로 형광은 이동에 관한 추가적인 요소들을 모니터링하는 데 사용합니다. 그러나 이 방법을 표준 컨트라스트 방법으로 사용해서는 안 됩니다. 광퇴색(photobleaching)과 광독성(phototoxicity)이 세포의 이동에 상당한 변화를 야기할 수 있기 때문입니다.

  • PAULA는 미세 조정이 필요 없는 무조정(alignment-free) 위상차를 제공합니다.
  • 클릭 한 번으로 위상차를 활성화할 수 있습니다.
  • 필요한 경우 형광 대조(빨간색/초록색 발광, 예: GFP 및 dsRed 라벨링 세포 등)를 추가할 수 있습니다.

100% 채워진 세포층을 이용한 상처 치유(wound healing) 분석

적절한 타임 포인트를 찾는 것이 중요합니다. 대부분의 경우 상처 치유 분석은 100% 채워진 세포층을 이용하여 이루어집니다. 세포가 100% 채워진 상태에 도달한 상태에서 세포가 계속 자라도록 두는 경우, 세포가 떨어져 나오거나 인접한 세포가 억제될 수 있습니다. 따라서 적절한 타임 포인트를 찾아 상처 치유 분석을 시작하는 것이 성공적인 실험을 수행하여 의미 있는 결과를 도출하는 데 필수적입니다.

  • PAULA는 원하는 세포 컨플루언시에 도달하면 이메일을 통해 알려드립니다.
  • 앞으로는 세포 배양실에 가서 수동으로 세포를 확인하지 않아도 됩니다.
  • 이제 상처 치유(wound healing) 실험을 시작할 완벽한 순간을 찾으실 수 있습니다.

최적의 환경 조건이 중요합니다

상처 치유 분석은 "데드 엔드(dead end)" 분석을 통해 이루어지곤 합니다. 간극이 완전히 닫혔는지 확인하기 위해서는 세포 플라스크를 인큐베이터에서 꺼내어 세포를 수동으로 검사해야 합니다. 이러한 접근 방식은 시간이 많이 소요되고 정확하지 않습니다. 대안으로 세포 플라스크를 클라이밋 챔버에 장착된 현미경 스테이지에 그대로 둘 수도 있습니다. 원칙적으로 이러한 방법도 잘 작동하지만 온도와 CO2 변화를 완전히 배제할 수 없습니다. 그렇다면 가장 좋은 환경에 세포를 계속 두는 것은 어떨까요? 이는 세포 배양에 가장 최적화된 환경 조건을 가진 인큐베이터 안을 뜻합니다.

  • PAULA는 세포를 최적의 상태로 유지하는 일반 세포 배양 인큐베이터 안에 둘 수 있습니다.
  • 며칠이 지나도 초점이 유지됩니다. 재조정이 필요하지 않습니다.
  • PAULA는 타임 랩스 기록을 통해 현재 이동 속도와 간극 닫힘 비율, 50% 닫히는 데까지 걸리는 예상 종료 시간을 즉시 계산합니다.
  • 세포 상태와 결과를 어디에서나 지속해서 모니터링할 수 있습니다.

일관된 간극 크기가 중요합니다.

대부분의 경우, 세포 단층의 무세포 간극은 피펫 팁을 사용하여 수동으로 만들어집니다. 스크래치 크기는 주로 단층 표면에 가해지는 압력에 따라 달라집니다. 그러나 재현 가능한 결과를 얻으려면 일관된 스크래치 크기가 중요합니다.

  • PAULA에 통합되어 있는 자로 정확한 세포 간극 너비를 확인하실 수 있습니다.
  • 여러 플라스크에서 비교 가능한 간극 크기를 보다 쉽게 찾으십시오.
  • PAULA는 ibidi와 같은 인서트로 유도된 무세포 간극에도 사용할 수 있습니다.

재현성에 중요한 기타 파라미터

간극 크기 및 환경 조건 외에도 상처 치유(wound healing) 분석의 재현성에 영향을 미칠 수 있는 요소가 더 있습니다. 예를 들어 이미지 및 촬영 설정, 시스템 보정과 같은 기술 파라미터와 세포 패시지 넘버(passage number)와 같은 표본 조건이 있습니다. PAULA는 두 가지 유형의 파라미터를 모두 모니터링합니다.

  • PAULA는 세포의 패시지 넘버를 기록할 수 있습니다. 이 방법을 통해 유사한 세포 상태를 비교하고 있는지(사과를 사과 또는 오렌지와 비교)를 알 수 있습니다.
  • 조명과 같은 파라미터 미세 조정을 비롯하여 특정 표본에 사용되는 모든 개인 설정을 떠올려보세요.
  • 이제는 시스템에서 해야 하는 추가 보정이 필요하지 않습니다.

상처 치유 분석 쉬운 설정

상처 치유 분석 설정이 간단하고 반복하기 쉬워지면 결과의 재현성이 훨씬 높아집니다. PAULA를 통한 상처 치유 분석 설정이 얼마나 쉽고 배우기 쉬운지 직접 확인해보세요. 성공적인 상처 치유 실험을 시작하는 데에는 단 3단계만이 필요합니다.

  • 표본 정의
  • 타임 랩스 정의
  • 관심 영역 정의

결과 산출

실험이 종료되면 결과가 산출됩니다.

  • PAULA가 시간 경과에 따른 간극 닫힘 값과 이동 속도를 그래픽으로 표시해드립니다.
  • 간극 및 속도 계산에 사용할 타임 포인트를 임의로 정의할 수 있어 스크래치 경계면에서 죽어가는 세포의 효과를 제거할 수 있습니다.
  • 간극이 50% 및 100% 닫힐 때까지의 시간을 예측한 다음, 이 시간에 도달하게 되면 실제 값을 계산합니다.
  • 모든 데이터를 목록에 표시하고 엑셀 파일로 내보낼 수 있습니다.
Hela 세포로 진행한 상처 치유 분석 동영상입니다.
세포를 최적의 상태로 유지하는 일반 세포 배양 인큐베이터 안에 PAULA를 두십시오.
PAULA Cell Imager를 이용한 상처 치유 분석 쉬운 설정

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10x 위상차로 촬영한 HeLa 세포. 제공: Ralf Jacob 교수, 독일 마르부르크 대학교(University of Marburg)
PAULA가 HeLa 세포 상처 치유 단층에 만들어진 간극 분석.
PAULA가 HeLa 세포 상처 분석에서 간극이 닫히는 속도 및 이동 속도를 계산하는 예시입니다.