디지털 Light Sheet 현미경을 통한 3D 세포 생물학 워크플로우 개선

생체 내(In vivo) 같은 종양 스페로이드 모델을 이용해 세포 내 수준에서 암 발달 연구

발암에서 세포 내 메커니즘의 이해는 암 치료를 위해 매우 중요합니다. 인기 있는 세포 모델은 단분자막으로 성장한 암 세포입니다. 그러나 이 방법은 종양 세포와 주변 미세환경의 3차원(3D) 상호작용을 무시합니다. 자연 상태에 가깝게 악성도의 발달과 진행을 이해하려면 암 미세환경의 특성화가 중요합니다.

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기존 현미경 검사에 대한 도전

배양 방법의 수를 계속 증가시켜 암 세포를 3D 구체로 성장시킬 수 있습니다. 이러한 세포 스페로이드는 고형 종양의 특성을 닮고 생리학적 관련성이 있는 암 발달의 모델링에 적합합니다. 복잡한 3D 구조와 체적 크기는 기존의 광학 현미경에서 직면하는 문제입니다. 이러한 문제를 합리적인 시간 안에 시료의 세포 내 변화를 추적할 수 있는 Light Sheet 기반 현미경을 통해 해결할 수 있습니다.

결과의 증폭

Leica SP8 Digital LightSheet(DLS) 현미경을 사용해 세포 스페로이드를 관찰하면 표준 페트리 접시에서 세포 및 분자 프로세스에 관한 의미 있는 결과를 도출할 수 있고 암 연구에도 매우 적합합니다.

다중 위치 실험의 스페로이드 이미징 워크플로우

Leica Microsystems’ Digital LightSheet 모듈(DLS)을 모든 도립 공초점 Leica TCS SP8 현미경의 세로 축에 통합할 수 있습니다.

표준 페트리 접시에서 쉽게 시료를 전처리할 수 있어 시간을 절약할 수 있습니다.
단일 실험에서 여러 스페로이드를 이미징할 수 있어 생산적인 장기 관찰이 가능합니다.

Leica Digital Light Sheet 현미경에 대한 추가 정보

3D로 배양한 유선 상피 마이크로 스페로이드의 7.5시간 시간 경과 기록. 데이터 제공: BioQuant/DKFZ Heidelberg의 Intelligent Imaging Group(B. Eismann/C. Conrad)

3D 세포 생물학, 스페로이드, 오가노이드

지난 10년 동안 3D 세포 배양의 응용이 견고하고 신뢰할 수 있는 세포 모델로 크게 발전했습니다. 점점 더 많은 과학자들이 3D 세포 배양이 곧 기존의 단분자막 세포 배양을 대체할 것으로 확신하고 있습니다.

3D 세포 배양 모델의 최근 사례는 대장암(CRC)과 대장암의 복잡한 기본 발달 메커니즘에 대한 새로운 정보를 제공합니다. 이 경우 오가노이드가 질병 연구뿐만 아니라 재생 의학과 맞춤 의학에서 다양한 방법으로 가치 있게 응용될 수 있다는 사실을 알 수 있습니다.

3D Spheroid Culture Technology Trends 2016. HTStec 2016
Cristobal et al., Cell Reports, 2017
Dang et al., Cell Stem Cell, 2016
Shimokawa et al., Nature, 2017

A. 전처리

표준 유리 바닥 페트리 접시에서 시료를 전처리합니다. 캐필러리 같은 특수한 장치가 필요하지 않습니다.

한 실험 셋업 내에서 여러 시료를 전처리할 수 있습니다.

소량의 히드로겔에서 직접 여러 스페로이드를 배양
페트리 접시 안에 히드로겔을 몇 방울 떨어뜨린 후 이미 발달한 스페로이드를 히드로겔에 이식

[Translate to korean:] Spheroid transferred into a hydrogel drop

B. 봉입

스페로이드가 최적의 관찰성을 보장하는 위치로 가라앉도록 페트리 접시를 뒤집습니다.

다음 단계에서 히드로겔이 37°C에서 응고되어 스페로이드를 고정하는 겔이 생성됩니다.

마지막으로 페트리 접시를 다시 뒤집고 배양 배지를 채웁니다.

[Translate to korean:] Top: Hydrogel solidifies at 37°C; Bottom: Petri dish filled with medium

C. Light Sheet 이미징

페트리 접시를 Leica TCS SP8 DLS의 시료 홀더에 놓습니다. TwinFlect 미러는 빠르고 쉬운 이미징을 위해 양면 조명을 제공합니다. 이미지 인식 중에 광 노출이 극도로 낮아 장시간에 걸쳐 스페로이드의 자연 발달을 추적할 수 있습니다. Leica DLS 모듈은 단일 실험(다중 위치 실험)에서 여러 시료를 관찰할 수 있도록 설계되었습니다. sCMOS 카메라를 사용해 하나씩 차례로, 스택별로, 시간 경과에 따라 초당 60프레임 이상에서 시료를 스캔할 수 있습니다. 편리한 배양 조건을 위해 Okolab이나 TokaiHit 같은 여러 제조사의 배양 시스템을 추가할 수 있습니다.

[Translate to korean:] Multi-position experiment

D. 데이터 처리

이미지를 인식할 때 임시 메모리에서 하드 디스크나 서버 솔루션(예: Acquifer HIVE)으로 이미지를 연속 스트리밍해 이미지를 저장할 수 있습니다.

E. 시각화

이미지를 인식했으면 Leica LAS X 3D 소프트웨어의 3D 시각화 도구를 사용해 결과를 즉시 시각화할 수 있습니다.

특정 순간의 스페로이드를 3D로 관찰하거나, 인식한 데이터의 서브 볼륨을 검사해 서로 다른 마커로 표시된 각각의 세포 분열을 시각화할 수 있습니다.

F. 분석

서로 다른 유전적 배경에서 나왔거나 서로 다른 처리를 받은 스페로이드의 행동을 비교하는 것이 주요 과제입니다. 데이터 분석은 건강한 조직이나 손상된 조직 같은 정량적 정보를 수집해야 할 때 필수적인 도구입니다.

Leica LAS X 소프트웨어에는 강력한 2D 및 3D 분석 도구가 포함되어 있습니다.

G. 공유

tif나 jpeg 같은 일반적인 이미지 형식을 사용해 전 세계의 동료나 다른 연구소 또는 언론매체와 결과를 공유할 수 있습니다. 동영상도 mp4 형식으로 쉽게 내보낼 수 있고 Excel 보고서에서 정량적 결과를 추가로 평가할 수도 있습니다.

3D 생물학 관련 추가 자료

Ishiguro et al., Cancer Science, 2017: Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5378268/
Halfter and Mayer, Biotechnol J, 2017: Bringing 3D tumor models to the clinic- predictive value for personalized medicine.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28098436
Sato and Clevers, Cell, 2015: Snap Shot: Growing Organoids from Stem Cells
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26091044

다른 연구 분야: 신경과학

신경과학 분야에서 여러 발전이 있었지만, 그 중에서도 뇌 연구를 위해 지카 바이러스의 오가노이드 모델을 개발했습니다. 이 오가노이드는 발달, 발병 및 약물 검사의 이상적인 생체 외(In vitro) 모델입니다.