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FLIM-FRET을 사용한 Molecular interaction 추적

현대의 연구는 핵심 작업을 수행하기 위해 분자가 어떻게 상호 작용하는지를 조사합니다. 생물의학 연구는 FLIM-FRET을 사용해 이러한 상호 작용을 조사합니다.

SP8 FALCON은 FLIM 기기를 위한 새로운 속도 표준을 설정합니다. 매우 동적인 세포 이벤트에서 FRET을 지원합니다. 일상 실험에서 FRET 데이터를 인식하고 해석할 수 있습니다.

EPAC mT2-dVenus FRET을 표현하는 HeLa 세포의 Caged cAMP. UV 매개 cAMP 언케이징에 대한 EPAC 반응(중심부). 4 fps로 촬영한 동영상. 이미지 크기: 256 x256 픽셀. 컬러 눈금자(Lifetime): ns. Courtesy Kees Jalink, Bram van den Broek, NKI Amsterdam.¬¬¬¬¬¬¬

트롬빈 활성화 펩타이드를 사용한 시뮬레이션 후 칼슘 진동. 개별 세포의 반응이 Lifetime의 변화로 기록됩니다. 4 pfs로 촬영한 동영상. 이미지 크기: 256 x 256 픽셀. 컬러 눈금자(Lifetime): ns. Courtesy Kees Jalink, Bram van den Broek, NKI Amsterdam.

바이오센서를 통한 미묘하고 빠른 변화의 모니터링

바이오센서는 대사 활동, 신호 메커니즘, pH 및 미세 환경 변화를 보고하는 강력한 수단입니다.

SP8 FALCON은 막전위 동특성 같은 초고속 이벤트의 경우에도 형광 Lifetime에 포함된 정보에 액세스할 수 있습니다. 이 정보는 SP8 플랫폼이 제공하는 강력한 스펙트럼 이미징을 더욱 보완합니다.

신뢰할 수 있고 민감한 대사 이미징

자가 형광은 기존 이미징에서 성가신 존재입니다. SP8 FALCON은 이를 가치 있는 정보로 바꾸어줍니다. 이제 자가 형광을 대사 상태, 세포 분화 및 암 발달에 관한 보고 수단으로 바꿀 수 있습니다.

뿐만 아니라, SP8 FALCON은 형광 라벨링이 불특정하거나 생리적 조건을 파괴하는 상황에서 생조직의 이미징 콘트라스트를 지원합니다.

비 생리적 조건(pH 8.5)에서 포유류 세포의 자가 형광. 신호는 NAD/NADH 내생 풀과 관련이 있습니다. 산화 스트레스는 시간에 따른 형광 수명의 감소를 야기합니다. 원본 이미지 크기: 512 x 512 픽셀. 색상 막대 눈금(수명): ns. SP8 DIVE 및 SP8 FALCON을 사용한 2 photon 이미지 인식.
Intensity
FLIM

스펙트럼 옵션을 넘어서는 형광단 분리

형광 라벨링은 세포 내 구조를 구분하는 표준 방법입니다. 스펙트럼 분리는 매우 강력하지만, 때때로 방출 스펙트럼이 너무 가까울 때는 제한적입니다.

SP8 FALCON을 사용하면 추가적인 형광 Lifetime을 사용해 이러한 제한을 극복할 수 있습니다. 그 결과 여러 형광 프로브를 분리할 수 있습니다.

SP8 플랫폼의 옵션을 결합해 더 많은 자유를 누릴 수도 있습니다. 옵션으로는 백색광 레이저 여기원, 음향 광학 빔 스플리터(AOBS), 다중 채널 스펙트럼 검출 등이 있습니다.
 

이미지: Lifetime 콘트라스트로 구분한 세포 골격 구조. Alexa Fluor 555(그린)로 면역 표식을 한 Vimentin과 Alexa Fluor 546(블루)으로 면역 표식을 한 Tubulin. 형광단은 스펙트럼적으로 매우 유사하지만, 형광 수명 정보를 이용해 분리됩니다. 이미지 크기: 512 x 512 픽셀.

SP8 FALCON(FAst Lifetime CONtrast) 이미징

SP8 FALCON 현미경은 FLIM의 속도 한계를 극복하고 고속 수명 데이터의 문을 엽니다.

지금까지는 FLIM의 기술적 한계 때문에 고속 프로세스의 형광 수명 데이터로부터 추출한 기능 정보를 얻기 어려웠습니다. FLIM의 인식 속도는 공초점 강도의 기록보다 10배 이상 느렸습니다.

SP8 FALCON 이미징을 사용하면 적절한 속도로 세포의 동적 프로세스를 따라갈 수 있습니다. 이는 TCSPC(Time-Correlated Single Photon Counting)를 데이터 처리 및 분석을 위한 지능형 알고리즘과 함께 사용해 시간을 측정하는 새로운 방법 덕분에 가능합니다.

Alexa Fluor 555를 함유한 용액(녹색)에 있는 형광 비드의 단일 채널 이미지(자홍색). 형광 수명에 기반을 둔 형광단 분리는 16 fps(위), 27 fps(동영상 속도, 가운데), 83 fps(초고속, 아래) 등 다양한 속도에서 가능합니다. 염료 분리를 위해 수명 정보를 사용하는 것이 강도(그레이스케일)보다 훨씬 더 유리합니다. 동영상은 수명 구성요소의 픽셀별 피팅(fitting)을 보여줍니다. 프레임 크기: 512 x 64 픽셀. 기준자: 10 µm.
복잡한 시료를 간단하게 인식. 190 메가픽셀을 포함하는 722개의 타일로 구성된 고해상도 쥐 배아 모자이크 이미지. 4개의 특징적 형광 Lifetime이 있는 FLIM 데이터, 색상 코드. 인식: 1:23 h. 분석: 1:00 h

올인원 다중형식 이미징

SP8 FALCON을 사용하면 FLIM과 다른 형식의 결합이 그 어느 때보다도 쉬워집니다. 지금까지 연구자들은 복잡한 기록 작업과 성가신 파일 전송 작업을 처리해야 했습니다. SP8 FALCON을 사용하면 Lifetime 정보를 표준 공초점 워크플로우로 통합할 수 있습니다.

SP8 FALCON은 LAS X 인식 및 분석 소프트웨어와 완벽하게 통합됩니다. FLIM을 4개의 스펙트럼 채널에 동시에 기록하고 최대 10개의 채널에 순차적으로 기록할 수 있습니다. SP8 FALCON을 사용하면 3D 스택, 저속 촬영 시퀀스 및 큰 모자이크 틸팅 형식으로 Lifetime 콘트라스트에 접근할 수 있습니다.

새로운 LAS X NAVIGATOR를 사용하면 관찰 영역을 최대 10,000배 확대해 관심 영역을 확인하는 데 걸리는 시간을 절약하고 시료를 완전히 새로운 방식으로 조사할 수 있습니다.

페이저로 직관적인 형광 수명 정의

FLIM 페이저를 사용한 SP8 FALCON을 활용해 분석하여 형광 수명 성분을 2D로 시각화할 수 있습니다.

FLIM 페이저를 사용하면 미세 환경 변경 사항을 확인하고, 신호를 멀티플렉싱할 성분을 선택하며 FRET 효율성을 결정할 수 있습니다.

페이저 FLIM으로 STED 이미지의 해상도를 개선할 수 있습니다. STED 레이저파워를 적게 사용해도 동일한 해상도를 달성할 수 있습니다(Lanzanò et al., Nature 2015).

Alexa555-Palloidin 및 H2B mCherry로 라벨링된 세포. FLIM 페이저를 사용해 분리를 수행했습니다. 이 페이저 시각화는 두 가지 분포를 분명하게 보여줍니다. 제공: Dr. Martin Stöckl, Department of Biology, University Konstanz, Germany.

원클릭으로 원하는 결과 제공

LAS X 소프트웨어를 사용하면 마우스 클릭 몇 번만으로 일반적인 스펙트럼 이미징과 같은 방식으로 FLIM을 구현할 수 있습니다.

현미경을 보완 기술로 사용하더라도 필수 사항을 찾고 바로 이미징을 시작할 수 있습니다.

더욱 특화된 기능을 워크플로우로 접근할 수 있고 사용자의 편의를 위해 자동화할 수 있습니다.

실험에 집중하도록 원클릭 방식 지원: LAS X 소프트웨어를 통한 SP8 FALCON 제어

SP8 FCS로 분자 동력학 조사

형광 상관 분광술( FCS )은 현미경을 사용한 정량적 기법입니다. 이는 강도 변동을 기반으로 입자 농도, 확산 계수, 점성, 분자 질량, 결합 정수 및 광물리적 성질을 연구하는 데 사용됩니다. FCS와 FLIM을 결합하면 형광 수명 상관 분광술(FLCS) 실험이 가능합니다. FLCS는 분광적으로 분리할 수 없는 분자의 상호작용을 연구하고 Background 영향을 제거하는 데 사용됩니다. STED는 초점 볼륨을 낮춥니다. 이러한 이유 때문에 STED FCS는 공초점 FCS가 한계에 달하는 고농도 범위( >100 nM)에서도 분자 정보를 제공합니다.

전문가 의견 

"새로운 Leica FLIM/ FCS 솔루션은 놀라운 속도와 유연성 그리고 사용 편리성으로 적용성이 뛰어납니다."Prof Christian Eggeling, University of Oxford

"대부분의 FLIM 기기가 부착 장치인 상황에서 진정한 통합 시스템은 완전한 인식의 변화입니다. 굉장합니다!" - Prof. Enrico Gratton, UCI Samueli, University of California, Irvine

"Leica SP8 FALCON은 통합 공초점 및 수명 이미징을 제공하는 최초의 상용 시스템입니다." - Provost Prof. Scott E. Fraser, Ph. D., University of Southern California, Los Angeles

"저희는 Leica SP8 FALCON을 자세히 살펴보았습니다. 모든 점에서 전용 TCSPC 솔루션만큼 정확할 뿐만 아니라 직관적인 인터페이스, 빠른 처리 속도도 갖추고 있습니다. 저는 Leica SP8 FALCON가 기능 이미징의 게임 체인저라고 생각합니다." - Prof. Kees Jalink, Ph. D., Netherlands Cancer Institute, Amsterdam

위: 다목적 플랫폼 SP8(왼쪽), 나노현미경(현미경), 초고해상도(오른쪽)
아래: CARS(왼쪽), 광 시트(가운데), 다광자(오른쪽)

TCS SP8 제품군의 구성원

SP8 FALCON은 Leica Microsystems의 SP8 플랫폼의 최신 구성원입니다. 초고해상도의 공초점 현미경에서 STED 나노현미경에 이르기까지 다양한 연구 방법을 수용하도록 플랫폼을 구성할 수 있습니다.

그 결과 사용자들에게는 다목적성과 투자 보호 효과라는 혜택을 제공합니다.

SP8 플랫폼의 모든 기기는 사용자의 연구에 따라 조정이 가능한 개방형 시스템입니다.