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Melhore seu fluxo de trabalho de biologia celular em 3D com microscópios Digital Light Sheet

Elucide o desenvolvimento do câncer em nível subcelular com modelos de esferóides tumorais in vivo 

Compreender os mecanismos subcelulares na carcinogênese é de importância crucial para o tratamento do câncer. Os modelos celulares populares compreendem as células cancerígenas desenvolvidas em monocamadas. Mas essa abordagem desconsidera a interação tridimensional (3D) das células tumorais com o microambiente adjacente. Para entender o desenvolvimento e a progressão da malignidade em um contexto mais próximo da natureza, a caracterização de microambientes do câncer é crucial.

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Os desafios da microscopia convencional

Um número constante e crescente de métodos de criação permite que células de câncer sejam desenvolvidas em esferas 3D. Esses esferóides celulares imitam as propriedades de tumores sólidos e são adequados para modelar o desenvolvimento do câncer com relevância fisiológica. A estrutura complexa em 3D e o tamanho volumétrico representam um desafio para a microscopia ótica convencional. Isso pode ser superado com microscópios basesados em “Light sheet”, que permitem acompanhar alterações subcelulares em grandes amostras dentro de um tempo razoável.

Amplifique seus resultados

A investigação de esferoides celulares com o microscópio Leica SP8 Digital LightSheet (DLS) revela resultados significativos de processos celulares e moleculares em placas de Petri padrão e é muito adequado para pesquisas de câncer.

Fluxo de trabalho de imagem de esferóides com experimentos de múltiplas posições

O módulo da Leica Microsystems do Digital LightSheet (DLS) pode ser integrado no eixo vertical de qualquer microscópio confocal invertido da Leica TCS SP8.

  • Economize tempo com a fácil preparação de amostras em placas de Petri padrão.
  • A imagem de múltiplos esferóides em um experimento permite uma observação por longo tempo altamente produtiva.

Mais informações sobre o microscópio Leica Digital Light Sheet

Registro de imagens de 7,5 h de duração de microesferóide epitelial mamário desenvolvido em 3D. Dados de cortesia do Intelligent Imaging Group(B. Eismann/C. Conrad) da BioQuant/DKFZ Heidelberg

Biologia celular em 3D, esferóides, organóides

Na última década, a aplicação de culturas celulares em 3D cresceu significativamente e tornou-se um modelo celular sólido e confiável. Cada vez mais cientistas estão convencidos de que as culturas celulares em 3D substituirão as culturas convencionais de células em monocamadas. 

Exemplos recentes de modelos de cultura celular em 3D trazem novas ideias sobre o câncer colorretal (CRC) e seus mecanismos complexos de desenvolvimento subjacente. Neste caso, os organóides apresentam inúmeras aplicações valiosas na pesquisa de doenças, além da medicina regenerativa e personalizada.

 

  • Tendências de tecnologia da cultura de esferóides em 3D de 2016. HTStec 2016
  • Cristobal et al., Cell Reports, 2017
  • Dang et al., Cell Stem Cell, 2016
  • Shimokawa et al., Nature, 2017

Fluxo de trabalho de imagem de esferóides - Etapas

A. Preparação

A amostra é preparada em placas de Petri de fundo de vidro padrão. Não é necessário nenhum equipamento especial, como capilares.

Você pode preparar vários espécimes dentro de uma mesmo arranjo experimental

  • desenvolvendo vários esferóides diretamente em um pequeno volume de hidrogel ou – como alternativa
  • colocar várias gotas de hidrogel dentro da placa de Petri e transferir os esferóides já desenvolvidos para dentro deles.

B. Montagem

A placa de Petri é virada ao contrário para que os esferóides se afundem em uma posição que garanta observabilidade ótima.

Na etapa seguinte, o hidrogel solidifica a 37°C, produzindo um gel que armazenará os esferóides no lugar correto.

Finalmente, a placa de Petri é voltada para cima e preenchida com o meio da cultura.

C. Aquisição de imagem através do “Light Sheet”

Posteriormente, a placa de Petri é colocada no suporte de amostra do Leica TCS SP8 DLS . O espelho TwinFlect fornece iluminação de dois lados para imagens com facilidade e rapidez.. Graças à exposição de luz extremamente baixa durante a aquisição da imagem, é possível acompanhar o desenvolvimento natural dos esferóides durante longos períodos de tempo.

O design do módulo Leica DLS permite que você veja várias amostras em um único experimento (experimento de múltiplas posições). Elas podem ser escaneadas em mais de 60 quadros por segundo usando o chip completo de uma câmera sCMOS, uma após a outra, pilha por pilha e ao longo do tempo.

Para condições de desenvolvimento adequadas, você pode adicionar sistemas de incubação de vários fabricantes, como por exemplo, Okolab e TokaiHit.

D. Gerenciamento de dados

Salve suas imagens à medida que as adquire através da transferência contínua da memória temporária para o seu disco rígido ou para um servidor (por exemplo, Acquifer HIVE).

E. Visualização

Uma vez que as imagens sejam adquiridas, você pode visualizar imediatamente seus resultados com a ferramenta de visualização de 3D do software da Leica LAS X 3D. 

Observe seu esferóide em um certo momento do tempo em 3D, ou inspecione um subvolume dos dados adquiridos para visualizar divisões de células únicas marcadas com fluoróforos diferentes.

Video: Sub Volume de uma aquisição 4D de um micro-esferóide epitelial mamário. Núcleos em verde, citoesqueleto em vermelho. Dados de cortesia do Intelligent Imaging Group(B. Eismann/C. Conrad) da BioQuant/DKFZ Heidelberg

F. Análise

Comparar o comportamento de esferóides que são derivados de origens genéticas diferentes ou que tenham sido submetidos a tratamentos diferentes é um grande desafio. A análise de dados é uma ferramenta essencial quando se precisa coletar informações quantitativas, por exemplo,de tecido saudável e comprometido.

Uma ferramenta poderosa de análise 2D e 3D faz parte do software da Leica LAS X.

G. Compartilhamento

Compartilhe seus resultados com seus colegas, outras instituições ou qualquer mídia - de todo o mundo - usando formatos de imagem genéricos como tif ou jpeg. Os filmes podem ser facilmente exportados como vídeos de mp4 e seus resultados quantitativos podem ser avaliados em relatórios de Excel.

Leituras adicionais sobre biologia em 3D

Outras áreas de pesquisa: Neurociência

Na neurociência, entre outros avanços, um modelo de organóide para o vírus Zika foi desenvolvido para estudar o cérebro. Estes organóides são modelos in vitro ideais de desenvolvimento, de patogêneses de doenças e de triagem de medicamentos.