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Primeira tomografia crioeletrônica integrada

Revele mecanismos celulares em 3D com uma resolução subnanométrica

Por investigar totalmente mecanismos biológicos complexos, os pesquisadores do setor de life science precisam de informações estruturais confiáveis sobre as moléculas de interesse no contexto subcelular. Para isso, as moléculas de interesse e seu ambiente celular devem ter resolução subnanométrica e muito precisa. 

A Leica Microsystems e a Thermo Fisher Scientific trabalharam juntas para criar um fluxo de trabalho para tomografia crioeletrônica totalmente integrado que atenda essas necessidades de pesquisa: A transferência de amostra de dados segura  entre aparelhos garante a fácil navegação para regiões celulares que devem ser analisadas e resultados confiáveis com resolução subnanométrica.

Os dados são cortesia do Departamento de biologia estrutural molecular do Max Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Alemanha

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Produtos Cryo Clem 10

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THUNDER Imager Model Organism

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Flexible spectral confocal microscope platform with high photon efficiency

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THUNDER Imager 3D Live Cell e 3D Cell Culture

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Leica DM IL LED

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Fluxo de trabalho da tomografia crioeletrônica

Etapa 1: Vitrificação

As células investigadas foram cultivadas em uma grade de microscopia eletrônica.

Antes de ser congelada, a amostra é mantida em uma câmara com umidade controlada e temperatura estável.

Além disso, essa amostra é vitrificada por meio do congelamento por imersão com o congelador automático por imersão EM GP2.

O processo de vitrificação inibe a formação de cristais de gelo assegurando que o conteúdo celular seja o mais próximo possível do estado natural.

Etapa 2: Seleção

Para um fluxo de trabalho eficiente, as células adequadas e as regiões de interesse devem ser pré-selecionadas. Para isso, use o microscópio criolight Leica EM Cryo CLEM. A amostra pode ser transferida ao Thermo Scientific™ Aquilos™ para fresamento. Total conectividade entre os aparelhos significa que a região definida e coordenadas são transferidas de forma segura e precisa para relocalização imediata pelo Aquilos. Não é necessário desperdiçar tempo procurando pelas posições relevantes!

Para evitar a contaminação de uma amostra preciosa, o fluxo de trabalho de criotomografia integrado garante uma transferência segura da amostra entre os sistemas envolvidos. O sistema de cartucho protege sua amostra por todo o fluxo de trabalho fornecendo o fundamento sólido para resultados científicos confiáveis.

(Thermo Scientific, Krios e Aquilos são marcar comerciais da Thermo Fisher Scientific.)

Etapa 3: Fresamento

Após a pré-seleção e focalização no EM Cryo CLEM, a amostra é transferida para o Thermo Scientific Aquilos, um microscópio eletrônico Cryo DualBeam dedicado.

No passado, era impossível classificar o interior das células na resolução subnanométrica porque muitas amostras eram muito finas para terem a imagem processada pela tomografia crioeletrônica. 

O Aquilos supera as limitações de espessura ao usar um feixe eletrônico de varredura (SEM) e um feixe focado de íon (FIB). Enquanto o feixe eletrônico é usado para processamento de imagem, o feixe de íons de gálio garante o fresamento preciso das células vitrificadas. 

Ao processar o corte, forma-se uma fina película de gelo na membrana da grade e pode ser examinada com a tomografia eletrônica. 

Etapa 4: Criotomografia em 3D

A grade EM que transporta as células nas lamelas é transferida do Aquilos para a Thermo Scientific Krios™ G3i (Cryo TEM).

O Cryo TEM captura as imagens da área de interesse diversas vezes, de ângulos diferentes ao inclinar as amostras de forma incremental.

As imagens separadas são alinhadas e reconstruídas por computador para gerar uma tomografia tridimensional da membrana e de seu conteúdo com resolução subnanométrica.