O ensaio para cicatrização de feridas, frequentemente usado como sinônimo para ensaio de arranhões ou de migração, é uma ferramenta importante para a avaliação e medição da migração celular, sejam células individuais ou populações celulares. A migração celular é rigorosamente controlada durante processos ontogenéticos e, às vezes, pode sair de controle, como durante o desenvolvimento e progressão do câncer.
São algumas das questões importantes relacionadas à migração celular:
- Como um medicamento em especial altera a taxa de migração de minhas células?
- Com qual rapidez as minhas células podem migrar sob determinadas condições?
O experimento de cicatrização de feridas
O procedimento básico para realizar um experimento de cicatrização de feridas é bastante simples. Uma lacuna artificial e sem células é gerada em uma camada individual celular 100% confluente e a habilidade das células de fechar essa lacuna é monitorada.
Muitos parâmetros precisam ser considerados e padronizados para a obtenção de resultados confiáveis e reprodutíveis. As seções a seguir irão abranger alguns aspectos gerais sobre o monitoramento celular e demonstrarão como o PAULA pode ajudar a simplificar essas tarefas do fluxo de trabalho.
Métodos de contraste adequados
Em uma configuração padrão de microscópio de campo claro, a maioria das monocamadas de células são relativamente difíceis de detectar ou são até mesmo "invisíveis". Com o contraste de fase, o "formato" da célula é destacado, permitindo que as células sejam facilmente detectadas. No entanto, a configuração para um microscópio manual usando o contraste de fase pode ser complicada e morosa, especialmente para usuários não treinados. Em geral, a fluorescência pode ser usada para monitorar fatores de migração adicionais. Porém, ela não deve ser usada como um método de contraste padrão, pois o photobleaching e a fototoxicidade podem alterar significativamente a migração.
- O PAULA oferece um contraste de fase livre de alinhamento, onde nenhum ajuste fino é necessário.
- O contraste de fase pode ser ativado com apenas um clique.
- O contraste de fluorescência (emissão vermelha e verde, como células rotuladas GFP e dsRed) pode ser adicionado, se necessário
Ensaio de cicatrização de feridas com uma camada celular confluente de 100%
A localização do tempo específico correto é importante. Na maioria dos casos, os ensaios de cicatrização de feridas são realizados com uma camada celular confluente de 100%. Para manter as células em crescimento após terem atingido 100%, a confluência pode induzir desprendimentos de células e até mesmo a inibição de células vizinhas. Portanto, encontrar o tempo específico correto para iniciar o ensaio de cicatrização de feridas é essencial para a realização de experimentos bem-sucedidos, que gerem resultados significativos.
- O PAULA informa via e-mail quando suas células atingirem a confluência desejada.
- Você não precisa mais ir para o laboratório de cultura celular e verificar manualmente as células.
- Você pode encontrar o momento perfeito para iniciar o experimento de cicatrização de feridas.
É essencial haver condições ambientais ideais
Ensaios de cicatrização de feridas são realizados frequentemente usando uma análise chamada "dead end" (sem saída). Os frascos de células precisam ser removidos da incubadora e as células são verificadas manualmente, para determinar quando a lacuna é totalmente preenchida. Essa abordagem é demorada e imprecisa. Como alternativa, o frasco de células pode ser mantido na platina do microscópio, equipada com uma câmara climatizada. Em princípio, isso funciona bem, mas as flutuações de temperatura e do CO2 não podem ser totalmente excluídas. Assim, por que não manter as células onde elas têm maior probabilidade de dar certo? Isso significaria uma incubadora com as melhores condições ambientais possíveis para a cultura celular.
- O PAULA pode ser colocado dentro de uma incubadora comum de cultura celular, onde as células são mantidas sob condições ideais.
- O foco fica estável ao longo de diversos dias - sem a necessidade de reajuste.
- O PAULA captura registros com intervalos de tempo e calcula, instantaneamente, a taxa de migração atual, além do percentual de fechamento da lacuna, bem como o tempo estimado para um fechamento de 50%.
- O status da célula e os resultados podem ser monitorados constantemente em qualquer lugar.
O tamanho consistente da lacuna é importante
Em muitos casos, a lacuna sem células na monocamada é criada manualmente com a ponta de uma pipeta. O tamanho do arranhão depende amplamente da pressão aplicada na superfície da monocamada. No entanto, para a obtenção de resultados reprodutíveis, é importante que o tamanho do arranhão seja consistente.
- Determine a largura exata da lacuna da célula com a régua integrada do PAULA.
- Encontre tamanhos de lacuna que podem ser comparados mais facilmente entre diferentes frascos.
- O PAULA também pode ser usado para lacunas livres de células induzidas por inserção, como da ibidi.
Outros parâmetros importantes para reprodutibilidade
Além do tamanho da lacuna e das condições ambientais, há outros fatores que podem influenciar a reprodutibilidade dos ensaios de cicatrização de feridas. Por exemplo, parâmetros técnicos como configurações de imagem e captura e a calibração do sistema, assim como condições do espécime, como o número de passagem das células. O PAULA monitora ambos os tipos de parâmetros.
- O PAULA pode registrar o número de passagem das células. Dessa forma, você sabe, a todo o momento, se está realmente comparando estados celulares similares (maçãs com maçãs ou laranjas com laranjas).
- Recupere todas as suas configurações pessoais usadas para um espécime em particular, incluindo o ajuste fino de parâmetros, como os de iluminação.
- Não é necessário calibrar adicionalmente o sistema.
Fácil configuração do ensaio de cicatrização de feridas
Se a configuração de um experimento de cicatrização de feridas for simples e fácil de ser repetida muitas vezes, os resultados têm uma probabilidade muito maior de serem reproduzíveis. Comprove você mesmo como a configuração do ensaio de cicatrização de feridas é fácil e autoexplicativa com o PAULA. Somente 3 etapas são necessárias para começar um experimento de cicatrização de feridas bem-sucedido.
- Defina o seu espécime
- Defina o seu intervalo de tempo
- Defina a região de interesse
Os resultados são importantes
No final, o que realmente importa são os resultados.
- O PAULA oferece uma exibição gráfica dos valores de fechamento da lacuna e taxas de migração ao longo do tempo.
- Os tempos específicos usados para os cálculos de lacuna e taxa podem ser definidos arbitrariamente, para que possam ser eliminados os efeitos das células em processo de morte nas bordas do arranhão.
- Os tempos para o fechamento de 50% e 100% da lacuna são estimados primeiro e, depois, os valores reais são calculados, se atingidos.
- Todos os dados podem ser exibidos em uma lista e exportados para arquivos do Excel.
