Um microscópio ótico é muitas vezes um dos principais dispositivos em um laboratório de pesquisa biológica. Ele pode ser usado para várias aplicações que esclarecem muitas questões científicas. Desta forma, a configuração e as características do microscópio são cruciais para a atender a aplicação, variando desde campo claro através de microscopia de fluorescência até a observação de células vivas. Este artigo oferece uma breve visão geral dos recursos relevantes do microscópio e envolve as principais perguntas que se deve considerar ao selecionar um microscópio de pesquisa.
Que tipo de amostra você usa?
Uma das primeiras coisas a considerar ao selecionar um microscópio de pesquisa é o tipo de amostra que você deseja explorar. Para amostras fixas aplicadas em uma lâmina de vidro fino, você pode usar um microscópio vertical. As células vivas exigem características especiais do microscópio porque são mantidas em vasos de cultura de células relativamente grandes, cheios com meios de cultura de células. Apenas uma configuração invertida, com o objetivo abaixo e o condensador acima da amostra, favorece o espaço livre essencial e a proximidade necessária do objetivo em relação à amostra. Ao mesmo tempo, um microscópio invertido mantém uma boa acessibilidade às células para, por exemplo, adicionar micromanipuladores. Além disso, células vivas demandam um ambiente adequado para sobreviver. A temperatura e concentração de CO2 devem ser mantidos em determinados níveis. Uma câmara climática com os controladores correspondentes é necessária para esta tarefa.
Esquerda: Lâmina de vidro para aplicação de amostras fixas, por exemplo secções histológicas. Direita: Placa de Petri para uso de cultura de célula.
Esquerda: Um microscópio vertical tem o objetivo acima e o condensador abaixo da amostra. Esta disposição é perfeita para observar uma amostra em lâminas de vidro. Direita: Em um microscópio invertido, este conjunto é virado, dando aos utilizadores mais espaço, além da proximidade necessária do objetivo em relação às amostras colocadas em bases maiores, como, por exemplo, células vivas.
Em que dimensões você pensa?
Amostras microscópicas espalhadas em três dimensões: comprimento, largura e altura. Considerando que alguns espécimes, tais como secções histológicas, são imagens apenas na direção xy, existem outras aplicações exigindo também a dimensão z. Para visualizar volumes 3D, por exemplo, de células vivas, um revólver motorizado de objetivos é recomendado por ser capaz de guiar sua amostra passo a passo através do foco. O software de imagem deve ser capaz de reconstruir cada imagem para visualização 3D. Para células vivas você tem que adicionar o tempo de dimensão. Neste caso, a estabilidade do sistema, por exemplo, é outra característica crítica. Devido ao fato de que as mudanças de temperatura influenciam o sistema de imagem durante a aquisição, medidas eficazes de contagem são essenciais. Um ajuste de foco automático, como o Controle de Foco Adaptável (AFC), neutraliza essas influências térmicas e sempre encontra o foco predefinido.
O Controle de Foco Adaptável (AFC) estabiliza automaticamente o foco do microscópio também durante a aquisição por lapso de tempo de longo prazo. Um sensor detecta movimentos de um feixe de LED (850 nm) que ocorrem caso o vidro de cobertura que transporta o espécime mude sua posição devido, por exemplo, à atividade térmica.
Qual método de contraste é o melhor para sua amostra?
A maioria das células – especialmente animais – analisadas com um microscópio não têm contraste intrínseco suficiente para visualização de pequenos detalhes. Pesquisadores usam métodos de contraste para resolver este problema. Enquanto o contraste de fase (PH) e o contraste de interferência diferencial (DIC) manipulam a luz que passa através da amostra para adicionar contraste, você também pode aplicar corantes fluorescentes (Imunofluorescência) usando proteínas fluorescentes. De acordo com o método de contraste, o microscópio necessita de equipamento específico; por exemplo: o contraste de fase necessita de objetivos especiais, enquanto o DIC utiliza certos prismas que têm de ser direcionados para o caminho da luz. Para a microscopia de fluorescência, são necessários cubos de filtros especiais, permitindo que os comprimentos de onda de luz corretos acessem e saiam da amostra.
Série de células neuronais adquiridas com diferentes métodos de contraste. Da esquerda para a direita: Campo claro, DIC, Contraste de fase, Fluorescência
E quanto à fonte de luz?
A escolha do método de contraste também determina a fonte de luz. A iluminação transmitida para microscopia de campo claro convencional, contraste de fase e DIC pode ser realizada com iluminação halógena ou LED. A microscopia de fluorescência pode ser realizada com iluminação LED ou com o auxílio de mercúrio, xenônio, ou lâmpadas de haletos metálicos de mercúrio.
Você deseja documentar ou publicar seus resultados?
Se você deseja registrar uma imagem de sua amostra ou realizar imagens de células vivas, é necessária uma câmera digital de microscópio. Especialmente no caso da imagem de célula viva por fluorescência, uma câmera sensível é recomendada para minimizar a quantidade de luz de excitação, que pode prejudicar as células. Além das já conhecidas câmeras