Um microscópio ótico é muitas vezes um dos principais dispositivos em um laboratório de pesquisa biológica. Ele pode ser usado para várias aplicações que esclarecem muitas questões científicas. Desta forma, a configuração e as características do microscópio são cruciais para a atender a aplicação, variando desde campo claro através de microscopia de fluorescência até a observação de células vivas. Este artigo oferece uma breve visão geral dos recursos relevantes do microscópio e envolve as principais perguntas que se deve considerar ao selecionar um microscópio de pesquisa.
Que tipo de amostra você usa?
Uma das primeiras coisas a considerar ao selecionar um microscópio de pesquisa é o tipo de amostra que você deseja explorar. Para amostras fixas aplicadas em uma lâmina de vidro fino, você pode usar um microscópio vertical. As células vivas exigem características especiais do microscópio porque são mantidas em vasos de cultura de células relativamente grandes, cheios com meios de cultura de células. Apenas uma configuração invertida, com o objetivo abaixo e o condensador acima da amostra, favorece o espaço livre essencial e a proximidade necessária do objetivo em relação à amostra. Ao mesmo tempo, um microscópio invertido mantém uma boa acessibilidade às células para, por exemplo, adicionar micromanipuladores. Além disso, células vivas demandam um ambiente adequado para sobreviver. A temperatura e concentração de CO2 devem ser mantidos em determinados níveis. Uma câmara climática com os controladores correspondentes é necessária para esta tarefa.
Esquerda: Lâmina de vidro para aplicação de amostras fixas, por exemplo secções histológicas. Direita: Placa de Petri para uso de cultura de célula.
Esquerda: Um microscópio vertical tem o objetivo acima e o condensador abaixo da amostra. Esta disposição é perfeita para observar uma amostra em lâminas de vidro. Direita: Em um microscópio invertido, este conjunto é virado, dando aos utilizadores mais espaço, além da proximidade necessária do objetivo em relação às amostras colocadas em bases maiores, como, por exemplo, células vivas.
Em que dimensões você pensa?
Amostras microscópicas espalhadas em três dimensões: comprimento, largura e altura. Considerando que alguns espécimes, tais como secções histológicas, são imagens apenas na direção xy, existem outras aplicações exigindo também a dimensão z. Para visualizar volumes 3D, por exemplo, de células vivas, um revólver motorizado de objetivos é recomendado por ser capaz de guiar sua amostra passo a passo através do foco. O software de imagem deve ser capaz de reconstruir cada imagem para visualização 3D. Para células vivas você tem que adicionar o tempo de dimensão. Neste caso, a estabilidade do sistema, por exemplo, é outra característica crítica. Devido ao fato de que as mudanças de temperatura influenciam o sistema de imagem durante a aquisição, medidas eficazes de contagem são essenciais. Um ajuste de foco automático, como o Controle de Foco Adaptável (AFC), neutraliza essas influências térmicas e sempre encontra o foco predefinido.
O Controle de Foco Adaptável (AFC) estabiliza automaticamente o foco do microscópio também durante a aquisição por lapso de tempo de longo prazo. Um sensor detecta movimentos de um feixe de LED (850 nm) que ocorrem caso o vidro de cobertura que transporta o espécime mude sua posição devido, por exemplo, à atividade térmica.
Qual método de contraste é o melhor para sua amostra?
A maioria das células – especialmente animais – analisadas com um microscópio não têm contraste intrínseco suficiente para visualização de pequenos detalhes. Pesquisadores usam métodos de contraste para resolver este problema. Enquanto o contraste de fase (PH) e o contraste de interferência diferencial (DIC) manipulam a luz que passa através da amostra para adicionar contraste, você também pode aplicar corantes fluorescentes (Imunofluorescência) usando proteínas fluorescentes. De acordo com o método de contraste, o microscópio necessita de equipamento específico; por exemplo: o contraste de fase necessita de objetivos especiais, enquanto o DIC utiliza certos prismas que têm de ser direcionados para o caminho da luz. Para a microscopia de fluorescência, são necessários cubos de filtros especiais, permitindo que os comprimentos de onda de luz corretos acessem e saiam da amostra.
Série de células neuronais adquiridas com diferentes métodos de contraste. Da esquerda para a direita: Campo claro, DIC, Contraste de fase, Fluorescência
E quanto à fonte de luz?
A escolha do método de contraste também determina a fonte de luz. A iluminação transmitida para microscopia de campo claro convencional, contraste de fase e DIC pode ser realizada com iluminação halógena ou LED. A microscopia de fluorescência pode ser realizada com iluminação LED ou com o auxílio de mercúrio, xenônio, ou lâmpadas de haletos metálicos de mercúrio.
Você deseja documentar ou publicar seus resultados?
Se você deseja registrar uma imagem de sua amostra ou realizar imagens de células vivas, é necessária uma câmera digital de microscópio. Especialmente no caso da imagem de célula viva por fluorescência, uma câmera sensível é recomendada para minimizar a quantidade de luz de excitação, que pode prejudicar as células. Além das já conhecidas câmeras CCD e EMDDC, hoje em dia as câmeras sCMOS se popularizaram, devido à sua alta eficiência quântica e velocidade de captura. Para obter mais informações sobre câmeras digitais de microscópio, leia o artigo Introdução à Tecnologia de Câmeras Digitais. Além disso, um campo de visão grande(FOV) ajuda a encontrar áreas interessantes mais rapidamente e a obter imagens de mais células ao mesmo tempo. Microscópios de pesquisa modernos apresentam um FOV de 19 mm na porta da câmera que coincide perfeitamente com uma câmera de chip de 19 mm sCMOS. Muitas vezes, não é suficiente apenas obter uma imagem da amostra, mas analisar os dados adquiridos. Para este propósito, o software de imagem, de uso simples, ajuda a obter dados quantitativos e fazer sólida análise de dados.
Você deseja manipular suas células no microscópio?
Ao longo dos últimos anos, a manipulação de amostras por foto se tornou popular. Isso significa que os pesquisadores não observam as células vivas, mas as manipulam com a ajuda da luz. A recuperação de fluorescência após o fotobranqueamento (FRAP) é um exemplo que ajuda a simplificar processos celulares dinâmicos. Para estes tipos de técnicas de manipulação, muitas vezes são necessárias fontes de luz adicionais que têm de ser integradas no caminho da luz do microscópio. Esta aproximação não é por acaso. A porta Leica Infinity Port é uma solução universal que acopla fontes luminosas adicionais no percurso de luz do microscópio sem afetar a qualidade da imagem a realizar, por exemplo, FRAP, foto-comutação, ablação ou optogenética. Com o adaptador certo, os pesquisadores podem até mesmo acoplar seus próprios dispositivos.
O módulo Leica WF FRAP (caixa preta à esquerda) pode ser conectado com o microscópio invertido Leica DMi8 via porta Infinity
Qual o seu orçamento?
Uma pergunta importante é quanto dinheiro você pode gastar. Alguns fornecedores de microscópio oferecem configurações pré-definidas que são adequadas para aplicações especiais. Mas e se você não precisa de todos os componentes pré-configurados pelos quais você terá que pagar? É por isso que uma configuração gratuita de componentes pode resultar em menor custo do que a compra de um sistema de microscópio predefinido. Além disso, os requisitos para um microscópio podem mudar com o tempo. Neste caso, um sistema que pode ser atualizado apresenta certas vantagens. Com uma configuração predefinida e fixa, você pode acabar preso a uma quantidade limitada de aplicações. A possibilidade de atualização oferece a liberdade de crescer conforme as mudanças de exigências. Tomando estes pontos em consideração, uma plataforma de microscopia modular, como o Leica DMi8, permite ao pesquisador começar com um sistema de microscópio acessível, que pode ser atualizado após um período de tempo de acordo com as demandas.
Graças à sua característica modular, o Leica DMi8 pode ser configurado de acordo com as necessidades dos pesquisadores. Ademais, ele pode ser atualizado a posteriori, se os requisitos mudarem.
Quem irá usar o microscópio?
A variedade de perfis de usuários pode ser bem distinta. Em especial no meio universitário, os usuários podem ser muito experientes ou completamente iniciantes. Assim, um sistema de microscópio de fácil uso, comandado por um software intuitivo, como o Leica Application Suite X (LAS X), ajuda rapidamente a introduzir as pessoas no campo de atividade e adquirir dados rapidamente. Por exemplo, um projeto orientado ao fluxo de trabalho, assistentes de análise de imagem e uma integração perfeita de periféricos no sistema, simplificam seu trabalho. Além dos microscópios de pesquisa para múltiplos campos, microscópios estéreo também são frequentemente utilizados em laboratórios de pesquisa biológica. Encontre mais informações no artigo "Fatores a Considerar ao Selecionar um Microscópio Estéreo".
