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Siga as interações moleculares com FLIM-FRET

A pesquisa moderna investiga como as moléculas interagem para cumprir tarefas vitais. Estudos biomédicos bem-sucedidos usam o FLIM-FRET para explorar essas interações.

O SP8 FALCON estabelece um novo padrão de velocidade para os aparelhos FLIM. Ele permite FRET em eventos celulares altamente dinâmicos. Você pode adquirir e interpretar os dados FRET em seus experimentos diários.

AMPc Caged em células HeLa que expressam o sensor EPAC mT2-dVenus FRET. Reposta do EPAC para liberação do AMPc mediado por UV (área central). Filme gravado em 4 fps. Tamanho de imagem: 256 x256 pixels. Escala da barra de cores (tempo de vida): ns. Courtesy Kees Jalink, Bram van den Broek, NKI Amsterdam.
Oscilação de cálcio após a estimulação com peptídeo ativado pela trombina. A resposta em células individuais é gravada como uma mudança no ciclo de vida. Filme capturado em 4 pfs. Tamanho de imagem: 256 x 256 pixels. Escala da barra de cores (tempo de vida): ns. Courtesy Kees Jalink, Bram van den Broek, NKI Amsterdam.

Monitore mudanças sutis e rápidas com biossensores

Os biossensores são poderosos marcadores da atividade metabólica, mecanismos de sinalização, pH e mudanças em microambientes.

SP8 FALCON propicia o acesso a essas informações contidas na vida útil da fluorescência, mesmo em eventos ultrarrápidos como a potencial dinâmica da membrana. Essas informações complementam o já poderoso processamento de imagem fornecido pela plataforma SP8.

Aquisição de imagem metabólica mais confiável e sensível

A autofluorescência é um incômodo na aquisição de imagens convencional. SP8 FALCON transforma-a em informações valiosas. Agora, você pode transformar a autofluorescência em um marcador do status metabólico, diferenciação de células e desenvolvimento de câncer.

Além disso, o SP8 FALCON permite o contraste de aquisição da imagem em tecidos vivos em que marcação fluorescente é, geralmente, não específica ou destrói as condições fisiológicas.

Autofluorescência em células de mamíferos em condições não fisiológicas (pH 8.5). O sinal correlaciona com mudanças no conjunto endógeno NAD/NADH. O desenvolvimento de esforço oxidativo representa a diminuição do tempo de vida de fluorescência com o passar do tempo. Tamanho da imagem original: 512 x 512 pixels. Escala da barra de cores (tempo de vida): ns. Aquisição de imagem de dois fótons realizada com SP8 DIVE e SP8 FALCON.
Intensity
FLIM

Separação de fluoróforos além de opções espectrais

Marcação por fluorescência é a maneira padrão para diferenciar as estruturas intracelulares. A separação espectral é muito poderosa, mas pode ser limitada quando os espectros da emissão são muito próximos.

Com o SP8 FALCON, você pode superar esse limite usando a dimensão adicional do tempo de vida de fluorescência . Isso desbloqueia o potencial de separação de diversas sondas fluorescentes.

Você pode usufruir de maior liberdade ao combinar opções da plataforma SP8. As opções incluem a fonte de excitação a laser de luz branca, divisor de feixe acústico-óptico e detecção espectral multicanal.
 

Imagem: As estruturas citoesqueléticas diferenciadas pelo contraste por tempo da vida. Imunomarcação de vimentina com Alexa Fluor 555 (verde) e a tubulina imunomarcada com Alexa Fluor 546 (azul). Os fluóforos são espectralmente muito semelhantes, mas elas são separadas usando as informações do tempo de vida de fluorescência. Tamanho da imagem: 512 x 512 pixels.

SP8 FALCON é FAst Lifetime CONtrast

O microscópio SP8 FALCON supera os limites de velocidade do FLIM e abre a porta para dados rápidos sobre o tempo de vida de fluorescência.

Até agora, era muito difícil obter as informações funcionais extraídas dos dados sobre o tempo de vida de fluorescência dos processos rápidos devido às restrições técnicas do FLIM. A velocidade de aquisição FLIM era pelo menos 10 vezes mais baixa que a gravação da intensidade do sinal confocal.

Com o rápida aquisiçãode imagens de contraste de tempo de vida do SP8 FALCON, você pode seguir processos dinâmicos em células no ritmo adequado. Essas tarefas são possíveis devido a uma nova maneira do medir o tempo usando o TCSPC (Time-Correlated Single Photon Counting) combinado aos algoritmos para manuseio e análise de dados.

Imagem em único canal de esferas fluorescentes (magenta) em uma solução que contém Alexa Fluor 555 (verde). É possível fazer a separação fluorescente com base no tempo de vida da fluorescência em diversas velocidades 16 fps (superior), 27 fps (taxa de vídeo, meio) e 83 fps (inferior, ultrarrápido). Usando as informações do tempo de vida para a separação dos sinais é significativamente mais vantajoso que usando a intensidade (escala de cinza). Os filmes mostram o ajuste pixel por pixel dos componentes do tempo de vida. Tamanho da imagem: 512 x 64 pixels. Barra de escala: 10 µm.
Aquisição direta de amostras complexas. Imagem em mosaico do embrião do rato em alta resolução de 722 miniaturas contendo 190 Megapixels. Os dados FLIM adequados com quatro tempos de vida por contraste característicos e codificados por cor. Aquisição: 1:23 h. Análise: 1:00 h

Aquisição de imagem multimodal em uma só solução

Combinar FLIM com outras modalidades nunca foi tão fácil com o SP8 FALCON. Até agora, os pesquisadores tinham que lidar com a fiação complexa e tarefas complicadas de transferência de arquivos. Com o SP8 FALCON, você pode integrar a informação do tempo de vida em seu fluxo de trabalho confocal padrão.

O SP8 FALCON é totalmente integrado no software de aquisição e análise LAS X. Ele pode gravar FLIM em seus quatro canais espectrais simultaneamente e até 10 canais sequencialmente. O SP8 FALCON permite que você acesse contraste por tempo da vida em imagens 3D, sequências de tempo transcorrido e grandes mosaicos.

Com o novo LAS X NAVIGATOR, você pode expandir sua área de visualizada até 10.000 vezes, economizando tempo precioso na identificação de suas áreas de interesse e na exploração de suas amostras de uma maneira totalmente nova.

Definição direta de tempo de vida com fases

A análise com o SP8 FALCON usando FLIM oferece uma visualização 2D de componentes de tempo de vida.

Com o FLIM você pode acompanhar mudanças microambientais, selecionar componentes para multiplexar o sinal e determinar a eficiência do FRET.

O FLIM permite a melhoria da resolução em imagens STED. É possível obter a mesma resolução com menos potência de depleção STED (Lanzanò et al., Nature 2015).

Células marcadas com Faloidina-Alexa555 e H2B mCherry. Separação usando fasores FLIM. O gráfico de fases mostra claramente duas distribuições. Cortesia: Dr. Martin Stöckl, Departamento de biologia da Universidade de Konstanz, Alemanha.

Os resultados que você precisa – com um clique

O software LAS X permite FLIM com poucos cliques do mouse e a mesma filosofia de aquisição de imagem espectral de rotina.

Mesmo se você usar a microscopia como uma técnica complementar, você pode encontrar o essencial e iniciar a aquisição de imagem imediatamente.

Mais funções especializadas podem ser acessadas como fluxos de trabalho e permitem a automação para maior praticidade.

Filosofia de 1 clique para que se concentre em seus estudos: SP8 FALCON controlado pelo software LAS X

Investigue a dinâmica molecular com SP8 FCS

Espectroscopia de correlação de fluorescência ( FCS ) é uma técnica quantitativa na microscopia. Ela é aplicada para o estudo da concentração de partículas, coeficiente de difusão, viscosidade, massa molecular, constante de ligação e propriedades fotofísicas com base em flutuações de intensidade.

A combinação de FCS com FLIM possibilita experimentos de Espectroscopia de correlação de tempo de vida de fluorescência (FLCS). FLCS é usada para estudar a interação das moléculas que não são espectralmente separáveis e para eliminar a contribuição do fundo.

STED reduz o volume focal. Por esta razão, STED FCS oferece informações moleculares mesmo em altas faixas de concentração (>100 nM) onde o FCS confocal encontra seu limite.

Parte superior da imagem: Rastros de intensidade e curvas de autocorrelação para concentração diferente de Atto88; a amplitude diminui pelo aumento da concentração. Parte inferior da imagem: volume de excitação no caso de STED confocal (esquerdo) e 3D (direito). O volume menor, no caso de STED, permite a medição de flutuações em uma concentração molecular mais alta.

Feedback dos especialistas

"Analisamos o Leica SP8 FALCON. Ele é tão preciso quanto as soluções TCSPC dedicadas, mas com uma interface intuitiva e com velocidade turbo.” „Considero um divisor de águas para a aquisição de imagens funcionais." - Prof. Kees Jalink, Ph. D., Netherlands Cancer Institute, Amsterdam

"A nova solução FLIM/ FCS da Leica impulsionará sua capacidade de aplicação - extremamente rápido, flexível e pronto para uso."Prof Christian Eggeling, Universidade de Oxford

"Muitos aparelhos FLIM são acessórios, essa é uma total mudança de perspectiva: ter um sistema totalmente integrado – muito poderoso!" - Prof. Enrico Gratton, UCI Samueli, Universidade da Califórnia, Irvine

"O Leica SP8 FALCON é o primeiro sistema comercial que oferece aquisição de imagem confocal e por tempo de vida integrada que posso imaginar usando em um ambiente multiusuário." - Provost Prof. Scott E. Fraser, Ph. D., University of Southern California, Los Angeles

Acima: Plataforma versátil SP8 (esquerda), nanoscopia (meio), superresolução (direita)
Inferior: CARS (esquerda), luz (meio), multifóton (direita)

Membro da família TCS SP8

O SP8 FALCON é a última adição à plataforma SP8 estabelecida da Leica Microsystems. A plataforma pode ser configurada para atender diferentes métodos de pesquisa que varia da microscopia confocal com superresolução até a nanoscopia STED.

Para usuários, ele propicia maior versatilidade e proteção de investimento.

Todos os aparelhos da plataforma SP8 são abertos e adaptáveis às pesquisas do usuário, agora e no futuro.