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FLIM FRET – O método

FLIM-FRET: A régua molecular

 

Uma típica aplicação de FLIM é FLIM-FRET. FRET é uma técnica bem estabelecida para o estudo de interações moleculares. Examina a ligação das proteínas e também estima as distâncias intermoleculares em uma escala de angström. O sistema Leica TCS SP8 SMD juntamente com ferramentas avançadas de análise de FRET no software SymPhoTime do PicoQuant formam uma base sólida para a realização de tais estudos com uma alta qualidade.

Em um ensaio de FRET, os potenciais parceiros de ligação são marcados com fluoróforos espectralmente distintos, de tal forma que o espectro de emissão da molécula doadora sobrepõe o espectro de excitação da molécula receptora. Se os dois modelos de interação estiverem em estreito contato a uma distância de apenas alguns nanômetros, a doadora excitada poderá transferir sua energia para a receptora. Por sua vez, a receptora emite um fóton de fluorescência e o tempo de vida de fluorescência da molécula doadora diminui.

Motivação para FLIM-FRET

Os métodos de FRET com base em intensidade são muito suscetíveis a variações no nível de expressão ou difusão molecular inerente na amostra. Isso também se aplica às influências externas como movimentos da amostra e flutuação da excitação. A respeito disso, o FLIM-FRET representa uma grande vantagem, visto que é calibrado internamente. Isso permite medições de FRET independentes de tais perturbações. Se o FRET ocorrer, será observada uma redução do tempo de vida da doadora. Esse valor é uma medida da eficiência de FRET. A combinação de FLIM-FRET com SP FLIM pode ser usada para melhorar a qualidade dos dados e para otimizar a precisão dos dados quantitativos.