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Princípios básicos da microscopia confocal

Princípios básicos dos microscópios confocais

No microscópio confocal, todas as estruturas fora de foco são suprimidas na formação da imagem.

Isso é obtido por um arranjo de diafragmas que, em pontos da trajetória dos raios conjugados opticamente, agem, respectivamente, como uma fonte de luz pontual e como um detector pontual.

Os raios fora de foco são suprimidos pelo pequeno orifício de detecção.

A profundidade do plano focal, além do comprimento de onda da luz, é determinado em especial pela abertura numérica da objetiva usada e pelo diâmetro do diafragma.

Em um orifício de detecção mais largo, o efeito confocal pode ser reduzido.

Para obter uma imagem completa, o ponto da imagem é movido ao longo da amostra por scanners espelhados.

A luz emitida/refletida que passa através do orifício do detector é transformada em sinais elétricos por um fotomultiplicador e exibida em uma tela no monitor do computador.

Vantagens dos microscópios confocais

As principais melhorias oferecidas por um microscópio confocal em relação ao desempenho de um microscópio convencional podem ser resumidas da seguinte maneira:

  • Os raios de luz fora do plano focal não serão registrados.
  • A desfocagem não cria obscurecimento, mas corta gradualmente as partes do objeto à medida que se afastam do plano focal. Assim, essas partes se tornam mais escuras e, por fim, desaparecem. Essa característica é chamada de seccionamento óptico.
  • É possível gravar verdadeiros conjuntos de dados tridimensionais.
  • A varredura do objeto no sentido x/y, bem como no sentido z (ao longo do eixo óptico), permite visualizar os objetos de todos os lados.
  • Devido à pequena dimensão do ponto de luz da iluminação no plano focal, a luz difusa é minimizada.
  • Por processamento da imagem, muitas fatias podem ser sobrepostas, produzindo uma imagem de foco estendido que só pode ser obtida na microscopia convencional pela redução da abertura, sacrificando assim a resolução.