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Divisores de feixe

Um desafio fundamental na microscopia de fluorescência, incluindo a microscopia confocal, é a separação da luz de excitação, por exemplo, de um laser, e a luz de fluorescência da amostra. A luz de excitação deve atravessar até a amostra desimpedida, enquanto nenhuma parte dela deve contaminar o sinal de fluorescência, que é mais fraco por um fator de 10-5 (veja a Figura 1). Para uma comparação, essa relação é semelhante às intensidades de luz de uma vela pequena em contraste com as lâmpadas de halogênio de 1.000 W. Para garantir que a luz de fluorescência possa ser detectada sem contaminação pela luz de excitação, o divisor de feixe é o componente crucial para o contraste da imagem no trajeto do feixe. Para obter uma visão geral dos diferentes tipos de divisor de feixe em microscopia confocal, consulte o artigo correspondente no Laboratório de Ciências da Leica por Rolf Borlinghaus. A descrição a seguir se concentrará nos tipos específicos de divisores de feixe usados no Leica TCS SP8.

Figura 1: Divisor de feixe em microscopia de fluorescência. A luz de excitação (seta azul) é acoplada no canal de luz utilizando um espelho dicroico e passada para a amostra. Parte dela é refletida de volta para o divisor de feixe onde é bloqueada. A maior parte excita a fluorescência (seta vermelha tracejada) que passa através do divisor de feixe a ser detectado. Observe a dramática diferença na intensidade entre a luz de excitação e emissão por cinco ordens de grandeza.

LIAcroicos

Os LIAcroicos são um avanço dos divisores de feixe dicroicos. Esse último se comporta como um espelho semitransparente, que tem comprimento de onda seletivo, por exemplo, a luz azul se reflete, enquanto a luz verde pode atravessar. Isso significa que os espelhos dicroicos, como são chamados, são selecionados de acordo com um "deslocamento de Stokes" do corante fluorescente. As propriedades espectrais específicas de um divisor de feixe são determinadas por uma fina camada de revestimento óptico sobre um substrato de vidro. Os divisores de feixe dicroicos são filtros de interferência. O revestimento é fixado, por isso, para cada combinação de laser/corante, requer um divisor de feixe dedicado. Para conseguir isso, um conjunto de filtros é normalmente colocado em um dispositivo deslizante móvel ou um disco para mover para dentro e para fora do trajeto do feixe, conforme necessário. Como mostrado na Figura 1, o esquema tradicional utiliza um ângulo de 45° para o espelho dicroico, que apresenta vantagens para a separação geométrica da luz de excitação e de emissão, sendo os seus feixes ortogonais. No entanto, essa concepção não é igualmente permissiva para diferentes ângulos (linearidade) de luz polarizada. Consequentemente, uma parte da luz de fluorescência é perdida, o plano de polarização da qual passa a ter a orientação "errada". A explicação é o chamado ângulo de Brewster. Se a luz é transmitida ou refletida sobre uma interface ar-vidro, depende do seu ângulo de incidência. Para interfaces ar-vidro, o ângulo de Brewster é cerca de 56° muito próximo dos 45° tipicamente usado para os espelhos dicroicos. Encontre aqui aqui belas visualizações de interfaces ar-vidro por Srihari Angaluri e Kiril N Vidimce. Quando o ângulo de luz incidente é muito menor que 45°, esse efeito é eliminado. Por isso, os divisores de feixe dicroicos, ou dicroicos de baixa luz incidente, oferecem melhor contraste e sensibilidade em comparação com os divisores de feixe anteriores. Os LIAcroicos são personalizados e produzidos em casa para garantir a eficiência da divisão de feixe acessível.

AOBS

Apesar dos recentes avanços na produção de espelhos dicroicos, duas desvantagens inerentes ainda permanecem: Sendo filtros, eles sempre perdem alguma luz de fluorescência e o confinamento destes a um determinado comprimento de onda limita a flexibilidade do instrumento confocal. A perda de luz em dicroicos ocorre não só por causa da transmissão menor do que 100% acima da divisão do comprimento de onda, mas principalmente devido às características do filtro próximas a esse comprimento de onda. Tipicamente, os divisor de feixe dicroicos suprimem uma banda ao redor do comprimento de onda do laser de cerca de 20 nm de largura. Uma vez que essa região espectral muitas vezes contém o máximo de emissão do espectro de um corante, ocorrerá a perda de luz (veja a Figura 2, área amarela da fileira superior).

Figura 2: Características do filtro do divisor de feixe dicroico duplo mais antigo comparado com o AOBS. Uma banda espectral ao redor do comprimento de onda nominal do filtro é suprimida (luz branca vs. azul). A luz de fluorescência que passa através do filtro é detectada (azul escuro-verde), enquanto parte dela é perdida (amarela). Devido ao seu corte íngreme, o AOBS dificilmente sofre dessa deficiência inerente dos divisores de feixe dicroicos.

A solução para esse dilema é o uso de um conceito sem filtro para a divisão do feixe. Com o divisor de feixe acústico-óptico (AOBS), a Leica introduziu uma tecnologia de divisão do feixe, que age simultaneamente como um multiplexador para vários comprimentos de onda (Figura 3).

Figura 3: Divisor de feixe óptico-acústico (AOBS). Um cristal feito de óxido de quartzo homólogo de telúrio (TeO2) age como um defletor de comprimento de onda específico. Para tanto, uma onda acústica na faixa de kHz é acoplada no cristal, alterando assim suas propriedades de dispersão. Esse princípio pode ser aplicado a até oito comprimentos de onda de uma vez, através da superposição de várias frequências acústicas. O princípio físico subjacente baseia-se em deformações na estrutura cristalina, incluindo seus elétrons. Eles interagem com o campo elétrico de luz incidente e, portanto, guiam-na de forma diferente, dependendo do respectivo deslocamento dos elétrons.

Em termos práticos, principalmente em aquisição de imagens multiespectral, o corte íngreme do AOBS oferece uma divisão de feixe mais eficiente, permitindo a detecção de mais luz (Figura 4). Além do mais, ao usar espelhos dicroicos, determinadas combinações de corantes como uma marcação tripla de GFP, YFP e mCherry não podem ser gravadas simultaneamente. Não existe tal combinação de filtro, limitando, por isso, a flexibilidade experimental para combinar livremente qualquer marcador fluorescente (Figura 5A). O corte íngreme do AOBS novamente ajuda a atender esse requisito, permitindo que até mesmo bandas de emissão muito estreitas possam ser gravadas em paralelo, com o apoio do sistema de detecção sensível da Leica TCS SP8 (Figura 5B). Um exemplo de células vivas de GFP, YFP e mCherry sendo gravadas simultaneamente é fornecido aqui. Ainda mais combinações são possíveis porque o AOBS pode ser reprogramado para um comprimento de onda diferente em microssegundos e até mesmo dividir simultaneamente até 8 linhas de laser. Assim, a varredura sequencial de linhas oferece mais gravação multicanal pseudo-simultânea por cima daquelas simultâneas descritas acimas. A varredura sequencial não é possível com todas as combinações de filtros dicroicos em contraste. As propriedades do laser tornam o AOBS ideal para configurações multilaser onde 8! = 40.320 diferentes combinações são possíveis. Isso se aplica ainda mais para o laser de luz branca (WLL2), onde literalmente resultam trilhões de combinações de excitação e a ideia de um confocal branco totalmente ajustável foi realizada.

Figura 4: Eficiência de luz do AOBS. Fileira superior: excitação (linhas pontilhadas) e espectros de emissão (linhas sólidas) em amostras multicor com Cy2 (verde), Cy3 (amarelo) e Cy5 (vermelho), respectivamente. Os preenchimentos da área representam a fluorescência transmitida a uma transmissão de > 90% dos divisores de feixe dicroicos (A) e do AOBS (B). A fluorescência detectável é integrada e expressa em relação ao espectro de emissão integrado do corante (C) respectivo. O AOBS transmite uma parte maior da luz de fluorescência (C, barras vermelhas) em comparação com os dicroicos (C, barras azuis).

Figura 5: Flexibilidade e velocidade com o AOBS. Os espectros GFP, YPF e mCherry são mostrados em verde, amarelo e vermelho, respectivamente, como na Figura 4. Nenhuma combinação de espelhos dicroicos pode gravar os espectros de emissão fortemente sobrepostos de GFP e YFP simultaneamente. A sobreposição das bandas típicas de comprimento de onda dicroicas é mostrada na área com preenchimento tracejado, não deixando espaço para a excitação necessária de 514 nm. Em contraste, o AOBS captura ambos os espectros em paralelo, permitindo a detecção de bandas muito estreitas em conjunto com o detector de SP e, opcionalmente, com os HyDs.

Exemplo de células vivas