Microscopia correlativa per sistemi ottici ed elettronici (CLEM)
Immagina di poter colmare facilmente il divario tra la scala micrometrica e quella nanometrica, collegando informazioni funzionali e ultrastrutturali. Per rispondere ad una domanda specifica in una ricerca, spesso significa utilizzare diverse tecniche di preparazione del campione e di microscopia e combinare più modalità, come l'imaging a cellule vive, il congelamento ad alta pressione, l'ultramicrotomia e la microscopia elettronica (crioelettronica). L'approccio CLEM aiuta a colmare questo divario.
Le soluzioni CLEM di Leica Microsystems garantiscono la vitalità dei campioni, la qualità dei campioni e un meccanismo di targeting 3D preciso e affidabile. Gli utenti possono sfruttare queste soluzioni per identificare direttamente la cellula giusta al momento giusto, ottenere dati crio-confocali ad alta risoluzione e inserire le informazioni sulla fluorescenza nel contesto ultrastrutturale.
I nostri esperti applicativi dedicati ai microscopi correlativi ottici ed elettronici sono lieti di fornirti la loro consulenza.
Per cosa viene utilizzata la CLEM?
L'approccio CLEM viene utilizzato per eseguire indagini più approfondite su un campione con risoluzione sub-nanometrica, che oltre a consentire la combinazione dei diversi strati di informazioni provenienti da una regione, consente anche di individuare una regione di interesse specifica nella massa totale: proprio come avere un faro quando si vaga nel buio.
Ad esempio, una proteina marcata può essere facilmente rivelata e mirata mediante microscopia a crio-fluorescenza per eseguire ulteriori analisi della struttura della proteina mediante crio-EM (leggi tutto su Coral Cryo). Un altro esempio può essere il caso in cui si desidera combinare le informazioni dinamiche (ad esempio, l'interazione cellula-cellula) con le informazioni strutturali e superare il limite della risoluzione della luce (leggi tutto su Coral Life).
Tuttavia, per quanto sembri semplice, realizzare un flusso di lavoro (Crio) CLEM regolare e di successo in effetti è molto difficile. Gli utenti dovrebbero valutare la possibilità di rispondere alle seguenti domande già nella fase di progettazione sperimentale:
- In che modo è possibile preparare e mantenere il campione in uno stato ottimale?
- In che modo è possibile identificare e contrassegnare le strutture target di interesse?
- In che modo è possibile spostare il campione in modo sicuro ed efficiente tra gli strumenti?
- In che modo è possibile fornire i dati di imaging e di target in un formato adatto per l'uso nelle fasi EM successive?
La gamma Coral aiuta a gestire il campione passo dopo passo, assicurando una maggiore affidabilità del flusso di lavoro CLEM.
In che modo vengono correlati i dati CLEM?
La correlazione tra microscopia ottica ed elettronica rappresenta un fattore fondamentale per eseguire correttamente un esperimento, sia a temperatura ambiente che con cryo-CLEM. È necessario stabilire e riconoscere i sistemi di coordinamento, utilizzando diverse modalità di imaging. Per recuperare le informazioni ad alta risoluzione con elevata precisione, le informazioni di imaging vengono sovrapposte mediante adattamento dell'immagine (per ampie panoramiche di dati) o tramite coordinamento assoluto delle posizioni (valori x, y, z).
Cosa si intende per cryo-CLEM?
La cryo-CLEM (microscopia correlativa ottica ed elettronica) consente di eseguire entrambe le fasi di imaging in condizioni criogeniche, il che implica la necessità di predisporre un flusso di lavoro affidabile per la preparazione dei criocampioni. Ciò include l'opportuna vetrificazione dei campioni, il trasporto dei campioni in condizioni di sicurezza e la stabilità dell'imaging a luce criogenica. È necessario prestare particolare attenzione alla contaminazione da ghiaccio: gli ambienti con elevata umidità e sporcizia LN2 possono compromettere facilmente il campione. Coral Cryo garantisce: 1) Manipolazione sicura e pulita dei campioni; 2) Imaging a luce criogenica stabile e a lungo termine; 3) Imaging e targeting preciso delle biomolecole all'interno dell'ambiente nativo utilizzando il software Coral Cryo.
Introduzione al flusso di lavoro Coral Life
L'imaging di cellule vive in fluorescenza rappresenta una modalità ampiamente utilizzata per visualizzare i processi cellulari nel tempo. Esistono tuttavia casi in cui le informazioni recuperate dalla microscopia ottica non sono sufficienti per fornire informazioni sui meccanismi cellulari. In tal caso, è richiesta un'immagine ultrastrutturale assoluta ad alta risoluzione, fornita dall'(RT) EM.
Il flusso di lavoro Coral Life di Leica Microsystems consente di tracciare e visualizzare nel tempo immagini di eventi cellulari rari utilizzando la microscopia fluorescente in un ambiente fisiologicamente sicuro. Una volta che si verifica l'evento di interesse, è possibile vetrificare il campione in soli cinque secondi per eseguire ulteriori analisi nell’RT EM (TEM, SEM, FIBB/SEM).
Questa operazione semplifica il trasferimento dei campioni dagli ambienti di coltura cellulare ben curati all'imaging a fluorescenza e alla vetrificazione rapida mediante congelamento ad alta pressione. Grazie al flusso di lavoro dalle cellule vive alla vetrificazione di Coral Life è possibile acquisire gli eventi delle cellule rare quando si verificano, rendendoli disponibili per l'analisi EM.
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