HyVolutionによる140nmの平面分解能

Super-sensitive HyD detectors and Huygens deconvolution can resolve structures of 140 nm. Specimen: single molecule DNA-origamis with 140 nm defined spacing. Comparison of results using HyVolution and confocal imaging.

フォトンカウンティングによる最大のダイナミックレンジ

優れたシグナルノイズ比

フォトンカウンティングは、従来の画像平均化を用いた撮影以上の、高いシグナルノイズ比を実現しています。画像平均化は、マルチアルカリまたはGaAsP PMTを使用している、一般的な共焦点顕微鏡における標準的な機能です。

 ライカ HyD は、イメージングでよく使用される高いカウントレートにおいて、単一光子の検出を可能とする高い時間分解能を持った、唯一の光検出器です。ライカHyDを使用することで、共焦点顕微鏡で用いられているどの検出器よりも、信頼できる画像を撮影して、そこから情報を得ることができます。

高いダイナミックレンジ

ライカHyDは、フォトンカウンティングからイメージングまでに必要なサンプリングレートをすべてカバーしています。1枚の画像に完璧な情報が含まれています。これは、共焦点顕微鏡を用いた実験への高いフレキシビリティがあり、データプロセシングから発生するアーティファクトが少ないことを意味しています。

フォトンカウンティングシステムのサンプリングレートは、シグナルノイズ比と強い関連性があります。例えば、15 MHzの低サンプリングレートによる従来のフォトンカウンティングシステムでは検出できる光子の数は少なく、比較的高いノイズを伴います。また、高いカウントレートではシグナルが飽和してしまい、定量性を失います。しかし、生体試料用いられる通常の蛍光色素では、15〜40 MHzのレートで光子が発生します。

ライカHyDは、迅速なサンプリングにより、低ノイズで光子の検出率が高く、PMTやAPD以上に良質な画像を取得することができます。HyDは、フォトンカウンティングモードでは最大60 MHz、標準モードでは最大300MHzでのサンプリングが可能です。

Photon counting allows as much information to be accumulated as needed for statistical analysis.

STED超解像

30nmの分解能

ライカTCS SP8 STED 3Xは、真の超解像を実現し、30nmの最大分解能を達成しています。ライカ TCS SP8 共焦点プラットフォームと完全統合されており、光の回折限界をはるかに超え、微細構造への迅速、直感的、そして純粋に光学的なアクセスを可能とします ― また、ライブセルイメージングに十分な速度で撮影が可能です。

Pulsed STED at 775 nm of 45 nm DNA Origamis
- 45 nm peak to peak
- FWHM of single peak sub 30 nm

30%以上の高効率で、近いスペクトルをもつ蛍光色素をイメージング

共焦点顕微鏡では、励起光が試料へ照射される光路と、同じ光路を通って蛍光を検出します。そのため、ビームスプリッタによって励起光と蛍光を分離することが必要です。

AOBS (音響光学ビームスプリッタ) は、完全に透過性のある、活性型二酸化テルル結晶TeO2で、最大限の光子効率を発揮します。結晶に音響波を当てることによって、その透過性を変化させます。音響波の周波数を変更するだけで、透過性はマイクロ秒オーダーで変化します。これにより、AOBSは、比類なくフレキシブルで、効率的、高速のビームスプリッタとなっています。

AOBSの反射帯域は、シャープな波長の立ち上がりと高い特異性をもち、従来よりも30%以上の明るさで蛍光の検出が可能です。

AOBSは、最大8つの励起光(反射帯域)に同時対応することができます。GFPとYFPの組み合わせによる同時イメージングに、近接した励起波長を使用することができます。これにより、アンミキシングや、アーティファクトを伴わずに、容易に蛍光を分離することができます。

Top: All wavelengths are fully flexible with the AOBS allowing to use closely spaced excitation lines like GFP and YFP.
Bottom: The steep edges of the AOBS increase transmission efficiency by 30%

ライカ HyDによる超高感度検出

繊細な生体試料のイメージングは、励起光を抑え、高い検出器ゲインでおこなわなければなりません。

ライカHyDの優れたシグナルノイズ比により、いかなる試料も細部まで捉えることができます。たとえばシグナルが散乱しやすい組織切片などであっても可能です。

ライカHyDは、ダークノイズを抑えることにより画像のコントラストを向上させ、すぐに論文やデータ発表に使用できる画像を得ることができます。

Gapless Photon Efficiency

フィルターフリーのスペクトル検出システムは、スペクトルのギャップを生じさせることなく、シームレスな波長可変による同時蛍光検出ができるように設計されています。

プリズムを用いた、この特許取得済みの機構は、最も効率的な波長分光を実現しています。回折格子ベースの機構とは対照的に光子のロスはなく、リサイクルループを構築する必要もありません。

最適なダイナミックレンジ

ライカのスペクトル検出器は、アレイベースのスペクトル検出機構とは異なり、最高の感度とダイナミックレンジでのバランスをカスタマイズすることができます。全てのアレイ素子で同じゲインを使うのではなく、カスタマイズされた検出器によって、検出器ごとにゲインを設定することができます。検出器はそれぞれ、光子のロスなく、様々な色素のダイナミックレンジに応じて最適化されます。これは、数理演算などによる再構成をすることなく、Linear Unmixing によって色素を分離する基本となっています。

Adaptive dynamic range of the SP detector. The SP detection design using individual point detectors avoids two inherent drawbacks of multianode arrays: Loss of dynamics and spectral gaps.

生体試料のための高速イメージング

タンデムスキャナは、切り替え可能なガルバノミラーにより、FOVスキャナとレゾナントスキャナシステムを統合しています。

  • 22 mm FOV – 最も広範な視野のポイントスキャニングシステム
  • X2Yスキャナ – 3つのミラースキャナによる均一な照明
  • 切り換え可能なガルバノミラーによる、FOVスキャナと、8 kHzまたは12 kHzのレゾナントスキャナシステムの組み合わせ
  • 最大12 kHzのスキャンで、40 fps (512 x 512 px) ~428 fps (512 x 16 px)を実現
  • SuperZ GalvoFlowと組み合わせることにより、同等システムよりもさらに最大50% 迅速に4Dスタックを取得
  • 高NA 対物レンズ や高感度のライカHyD RLDを用いた、解像度、感度、コントラストを妥協しないマルチフォトンイメージング
1800 Hz Conventional -> 12 khz Resonant -> SuperZ GalvoFlow

ライカ HyD

生存率を高めるソリューション

生細胞は、イメージングによる光毒性の影響を受けます。

超高感度のライカHyDにより、試料への励起光照射量を軽減することができます。これにより、試料の生存率が向上します。酵母や線虫のような繊細な生体試料も、優れた共焦点分解能とハイブリッド検出により観察が可能となります。

Live yeast cells double-labeled with EGFP at both the nuclear envelope and the telomere.

スペクトル検出器

ギャップレスな蛍光の同時検出

試料の様々な蛍光シグナルを識別するには、複数チャンネルを使って同時に検出できるスペクトル検出システムがなければなりません。

すべてのライカ TCS SP8に搭載されたスペクトル検出器は、 プリズムによる分光と連続可変スリットを用いて、5つの異なるチャンネルにおいて同時に蛍光検出ができます。

Graphic Prism Dispersion and Spectral Detection

AOBS and WLL

自在に調整可能な共焦点イメージング

TCS SP8 X に搭載されるWLL(ホワイトライトレーザー)は、470nm〜670nmのスペクトル領域をカバーする白色光源を特徴とします。

AOBSは、白色のスペクトルから任意の波長を選択するために重要で、WLLの性能を最大限に発揮させます。最大8つのラインがスペクトルから選択可能です。各ラインは、個々に波長や出力強度を自由に調節でき、8!= 40320の組み合わせが可能です。

連続可変の励起光およびビームスプリッタは、スペクトル検出器による連続可変の検出により完結します。検出波長域が可変のため、複数の励起光波長の間で自在に蛍光検出域を設定することができます。― 最大限の透過率と5つの真の蛍光チャンネルによる同時検出。これにより、真のマルチカラーアプリケーションが可能になります。

Top: The white light laser allows to detect up to 8 laser lines from the spectrum, all freely tunable in wavelength and intensity.
Bottom: All wavelengths are fully flexible with the AOBS allowing to record closely spaced excitation lines like GFP and YFP simultaneously. This is much faster than sequential recording.
4K Monitor coming with every Leica TCS SP8 plus LAS X 3D Visualization package.

LAS X Software

多様なオプション

ライカのソフトウェアプラットフォーム、Leica Application Suite X は、お客様の要求に合わせてカスタマイズすることができ、実験の計画、実行、分析をサポートします。

観察および解析

 作業の流れに合わせた設計と直感的なソフトウェアのウィザードは、段階を追って、画像取得、画像プロセシング、解析へと導いていきます。3D Visualization や Analysisのようなソフトウェアパッケージを追加することにより、お客様のニーズに合わせて X をカスタマイズします。それにより、3D画像で試料の形態を把握し、細胞内構造を様々な視点から定量化できます。

ライカTCS SP8およびLAS Xを使用することで、個々の実験および解析を極めて簡素化することができます。

Top: Without CAM. Important events may be missed. Bottom: With CAM. Time resolution is increased temporarily as needed. The process is studied in more detail and with better yield.

大きな視点で捉える

適時適所において、ブレイクスルーとなる発見はされるものです。ライカHCS Aはハイコンテントスクリーニングにより、その発見までの道のりを迅速化することが可能で、生物学的アプリケーションを標準化し、迅速かつ再現性のある結果を得ることができます。

Computer Aided Microscopy(CAM)を介して、 ImageJ や Cell Profiler等の画像分析ソフトウェアを用いることで、希少な現象を捉えることができます。データを外部ストレージに継続的に送り、データ取得と並行して画像分析を行います。ライカ HCS A は、分析ソフトウェアからのフィードバックに応じて、大規模なスクリーニングを単純化します。