显微镜在病毒学中的应用

Greb, Christoph

July 13, 2020

显微镜在病毒学中的应用

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引起新型冠状病毒肺炎（Covid-19）的冠状病毒SARS-CoV-2肆虐全球并影响了我们生活的方方面面。对于免疫和治疗方法的搜索研究（即如何抗击该病毒）成为了2020年全人类的第一要务。显微镜在这类研究中起着重要作用。为了了解受体结合、基因组释放、复制、装配和病毒出芽的基本原理以及我们的免疫系统效应，可以使用不同的方法和显微镜。本文概述了为什么显微镜是病毒学和感染生物学的重要工具，并举例说明了不同的显微技术及其在这些研究领域中的应用。

显微镜在病毒学领域内有着广泛应用

光学显微镜对于病毒学家来说应用范围很广。大多数光学显微镜是基于荧光的。荧光显微镜大致可分为免疫荧光和荧光蛋白的利用。免疫荧光利用固定的细胞或组织，用荧光标记的抗体对目标蛋白进行染色，而荧光蛋白也可用于活细胞成像。

病毒学中使用的显微镜包括宽场显微镜、共聚焦显微镜和超分辨显微镜。此外，激光显微切割也具有一定的适用性。

以下参考文献将让您概括了解比较突出的显微镜检查方法及其在病毒学中的应用：

细胞脂质代谢对新型冠状病毒复制的影响

Müller等人研究了细胞脂质代谢对冠状病毒复制的影响。他们用冠状病毒HCov-229E感染Huh-7细胞，并用抗dsRNA、冠状病毒N蛋白和冠状病毒NSP8蛋白的抗体对这些细胞进行染色。此外，他们还利用胞体磷脂PC-A2标记】。然后用配备63x平面复消色差物镜的TCS-SP5共聚焦显微镜进行成像。研究人员集中研究了dsRNA和PC-A2的共定位。

细胞质磷脂酶A2α（cPLA2α）产生磷脂。当他们用cPLA2α抑制剂处理细胞时，他们可以检测到对人类冠状病毒细胞中病毒RNA和蛋白质积累的显著影响。更详细地说，他们观察到RTC（病毒复制/转录复合物）与含有溶血磷脂的膜结构共定位。有鉴于此，他们得出结论，cPLA2α可能是抗病毒药物的靶点。

https://jvi.asm.org/content/92/4/e01463-17#sec-9

病毒有自己的RNA或DNA。鉴于这一事实，病毒可以通过荧光原位杂交(FISH)技术来进行检测，期间使用荧光探针对病毒核苷酸进行标记。

图1：病毒粒子的典型结构：蛋白质如聚合酶、核酸（RNA或DNA）、脂质双层（包被）、包膜蛋白、核糖核蛋白和衣壳。

免疫抑制机制的监测标志物

Jarret等人并没有对病毒进行研究而是对小鼠黏膜屏障的细菌感染进行了研究。通过单分子荧光原位mRNA杂交（smFISH；THUNDER Imager 3D Live Cell) ，他们发现肠神经元产生细胞因子IL-18。他们据此可以证明神经元衍生的IL-18信号在肠道免疫中起主要作用，这一研究成果此前尚未被发现。
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)31378-9

免疫抑制机制的监测标志物

免疫抑制可以在病毒感染小鼠模型的帮助下进行研究。对小鼠肺部进行了大型多通道扫描，以监测免疫抑制机制的标志物。用流感病毒感染小鼠，然后研究肺基底样结构的退行性变化 (THUNDER Imager 3D Cell Culture)。

图2：免疫荧光，角蛋白-5（绿色），PDL-1（红色）：小鼠肺切片，接种Puerto Rico 8流感病毒毒株诱导肺上皮损伤。感谢Cedars-Sinai医疗中心Andrew Beppu提供图片。

DENV诱导基因表达效应

Sim等人研究了登革热病毒（DENV）在黄热病蚊（埃及伊蚊）唾液腺中诱导的基因表达效应。作者发现，感染DENV后，蚊子唾液腺的转录组发生了改变。利用基因表达芯片进行基因表达分析，他们首次发现了一些基因的表达，这些基因对蚊子寻找和探测寄主的行为有影响。他们使用免疫荧光显微镜来识别蚊子化学感受器中病毒丰富的区域（见图3）。
https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1002631#s4

亨德拉病毒感染细胞的形态

Monaghan等人在显微镜的帮助下对亨德拉病毒感染细胞的形态进行了特征分析。共焦图像 (SP5) 揭示了细胞内病毒蛋白质的分布，而超高分辨率显微镜 (SR-GSD) 甚至可以近距离观察病毒颗粒内的蛋白质分布。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4254186/

与拉克罗斯病毒（LACV）核衣壳结合的细胞RNA解旋酶

Weber等人利用超高分辨率显微镜对与拉克罗斯病毒（LACV）核衣壳 (SR-GSD)相结合的细胞RNA解旋酶进行了研究。为此要在感染的A549细胞当中使用免疫荧光来对病毒LACV N蛋白质和细胞RNA解旋酶RIG-I进行染色。超高分辨率显微镜提供了RIG-I通过5’ppp dsRNA长链与核衣壳相结合的生化数据。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5515363/

自然杀伤（NK）细胞

Maze 和Orange研究了病毒中的重要对手——自然杀伤（NK）细胞。这些细胞从属于先天免疫系统，负责监视病毒感染和癌变细胞。通过免疫突触直接分泌特异性外泌体，杀死病毒感染的细胞。用STED纳米显微镜 (TCS SP8 STED) 研究了裂解颗粒与NK细胞骨架的相互作用。
https://www.leica-microsystems.com/science-lab/visualization-of-the-natural-killer-cell-immune-synapse-by-super-resolution-nanoscopy/

图4：病毒复制周期从与宿主细胞表面的受体结合开始。在内吞作用后，病毒内容物被释放到宿主细胞中。RNA（RNA病毒）可以直接翻译成蛋白质，而DNA（DNA病毒）必须首先转录。此外，病毒基因组在细胞核或所谓的病毒工厂中复制。之后，病毒组分组装起来再次形成一个完整的病毒颗粒，通过宿主细胞的质膜实现萌芽再感染其他细胞。溶胞病毒不会萌芽，但会破坏宿主细胞释放。

STED纳米显微镜成像免疫突触

Zheng等人的另一篇发表文献中阐述了使用STED纳米显微镜 (TCS SP8 STED)对免疫突触进行成像的技术流程。
https://www.jove.com/video/52502/super-resolution-imaging-natural-killer-cell-immunological-synapse-on

STED纳米显微镜揭示寄生虫学问题

除了病毒学和免疫学外，STED纳米显微镜还能够揭示寄生虫学问题，例如红细胞裂殖子入侵。3D STED (TCS SP8 STED) 发现了了疟原虫感染相关蛋白组分的空间信息。
https://www.leica-microsystems.com/science-lab/observing-malaria-infection-at-the-right-spot-in-the-human-host/

冠状病毒对细胞NF-κB信号传输及染色质分布的影响

Poppe等人研究了冠状病毒对细胞NF-κB信号传输及染色质分布的影响。借助激光显微切割（LMD6000），他们分离出了表达冠状病毒N蛋白的细胞并提取了其中的全部RNA。利用RT-qPCR和微阵列分析，他们发现了细胞中的哪些mRNAs表达不足或表达过度。此外，他们使用冠状病毒N蛋白质的免疫荧光来监测病毒感染及其在A546细胞（DMIRE2， DMi8)中的分布情况。
https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006286#sec002)

明场显微镜在病毒学中起着直接的作用，但只是次要的作用，因为荧光显微镜更好地满足了研究人员的需求。尽管如此，在研究动物组织时，明场显微镜还是有用武之地的。例如，研究人员可以检查病毒感染后组织的形态变化等。

此外，明场显微镜会在细胞培养实验室当中用于检查已经受到感染或者即将受到感染的细胞 (DM IL, DMi1, PAULA)的健康和生长状态(见图5) 。

图5：MDCK细胞（一种极化细胞系，与其他细胞系一同用于病毒学研究）的明场图像。

这份显微镜检查方法的清单并不全面。还有其他一些技术也可以用来可视化病毒，但不在本文的讨论范围内。例如，电子显微镜（EM）可以分辨病毒颗粒。单分子检测 (TCS SP8 SMD）和荧光寿命成像（FLIM） (STELLARIS 8 FALCON)以及多光子显微镜 (SP8 DIVE) 是适用于病毒学研究的其他方法（见参考资料）。