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Sistema HC da Leica Microsystems
O sistema HC (Sistema de Composto Harmônico) Leica inclui os componentes ópticos que foram combinados para a melhor geração de imagens e estão envolvidos na correção das aberrações ópticas: objetivas, oculares, lentes de tubos, adaptador para câmera e TV.
Para a correção de certas aberrações ópticas, o microscópio é considerado como um sistema inteiro. As aberrações esféricas, coma e as aberrações cromáticas axiais são mais bem corrigidas em seus locais de origem, ou seja, no componente específico. As aberrações cromáticas laterais e astigmatismo são corrigidas em paralelo na objetiva, na lente do tubo e na ocular.
O resultado ideal da imagem é, portanto, obtido por meio de interação das correções.
HC = A objetiva está incluída no sistema de Composto Harmônico.
HCX = A objetiva também é compatível com ópticas antigas (óptica Delta 1991-1997)
O sistema HC garante
- óptica balanceada e dimensões de encaixe mecânico,
- alinhamento balanceado de todos os componentes do sistema óptico,
- soluções técnicas balanceadas e confiáveis,
- excelente desempenho óptico com tecnologia de fabricação progressiva.
Ampliação da objetiva
Cada objetiva é classificada com sua ampliação, por exemplo, 5x ou 100x. No entanto, a ampliação da objetiva por si só não determina a ampliação global do microscópio. Isso resulta da ampliação da objetiva multiplicada pela ampliação da ocular (para lente de tubo de 1x).
Exemplo:
Objetiva de 40x x oculares de 10x = 400x de ampliação global.
No entanto, deve-se observar que quanto maior a ampliação da objetiva, menor será o campo visível do objeto.
Numerical Aperture
The numerical aperture (NA or A) of the objective is a key parameter for the optical image and determines the resolving power of the objective and the brightness of the image. It is defined by the sine of the half aperture angle a of the lens and the refractive index n of the immersion medium. According to this definition, the larger the numerical aperture, the more narrow the focal spot and hence the higher the resolving power.
The objectives are labeled with their magnification, followed by the particular NA value, for instance 10x/0.40 or 63x/1.40. The numerical aperture of the objective can be changed by using iris diaphragm objectives.
The term 'numerical aperture’ is explained in detail in the Leica Science Lab article: "Beware of "Empty" Magnification"
Iris Diaphragm
By using iris diaphragm objectives the numerical aperture of the objective can be changed. This is especially useful for widefield microscopy. If the iris diaphragm is closed, the numerical aperture and resolution are reduced but the depth of field is increased. If the iris diaphragm is opened again, the numerical aperture is increased, the resolution is increased, but the depth of field is decreased. An objective can also be used as a darkfield objective by narrowing the aperture.
Iris diaphragm objectives are labeled with the range within which the numerical aperture can be adjusted, for instance 1.4 – 0.7.
The physical relationship between aperture, resolving power and depth of field is shown in the graph. A small aperture produces low resolution but large depth of field. A high aperture means better resolution but less depth of field.
Linear correlation between aperture and resolution (green), respectively exponential correlation between aperture and depth of field (red)
Correction Collar
The performance of high-resolution objectives is optimal when the refractive indices of the specimen and all intermediate optical media match the values for which the objective is designed. Changes in coverglass thickness and temperature as well as inhomogeneous, thick specimens introduce refractive index mismatches. This causes deterioration of the point-spread function, geometric distortion, and chromatic aberration. These effects limit penetration depth, contrast, and intensity of the microscope images.
Immersion oil traditionally has a refractive index close to standard crown glass. Oil immersion objectives are designed for the refractive index of this oil. They are optimal when working close to the coverglass or with samples embedded in a medium with a refractive index close to that of immersion oil. For samples with refractive indices deviating from this value special objectives are offered. Most common are water immersion objectives, and glycerol immersion objectives. Water and glycerol immersion objectives are very sensitive to changes in coverglass – introducing a changing thickness of a medium with refractive index mismatch – temperature, and deviations of the immersion medium or the sample itself. Therefore, water and glycerol immersion objectives with a higher NA have a correction collar to compensate for those differences.
The correction collar axially moves the central lens group and can be used to restore optimal image resolution and brightness. As manual adjustment of the correction collar requires time and experience and can disturb the sample, Leica offers water immersion objectives with a motorized correction collar.
CORR = Objective with correction collar
Distância de trabalho extra longa
A área acessível da amostra geralmente é limitada por colisões da objetiva com o suporte da amostra, as bordas de uma placa multicavidade ou equipamentos adicionais, por exemplo, para aquisição de imagens de eletrofisiologia ou intravital. As objetivas com uma distância livre de trabalho extra longa também permitem gerar imagens das bordas de tais amostras sem restrições. A aquisição de imagens de tecido profundo por excitação multifotônica ou em tecidos desimpedidos também requer uma grande distância livre de trabalho para aproveitar plenamente os benefícios das vantagens ópticas dessas técnicas. Aqui, a necessidade de distâncias de trabalho superiores a um milímetro não são incomuns. No entanto, a abertura numérica da objetiva ainda precisa ser a maior possível para fornecer imagens significativas em alta resolução.
A Leica Microsystems oferece uma gama de objetivas com distância livre de trabalho excepcionalmente grande para imersão em água e a seco. As objetivas de imersão em água com distâncias de trabalho extra longas também estão disponíveis com um ângulo de acesso maior e um painel frontal de cerâmica inerte com mínima condutividade elétrica e térmica para eletrofisiologia.
L = Objetiva com distância livre de trabalho extra longa
Objetivas de imersão em água com distâncias livre de trabalho extra longas
HCX APO L 20x/1.0 W com rosca M32 para uso no Leica DM6000 FS e CFS, FWD: 2 mm
HCX IRAPO L 25x/0.95 W com rosca M25 para uso em todos os microscópios, FWD: 2,5 mm
HCX APO L série U-V-I, FWD: 2,2 – 3,6 mm
Plano focal posterior
As objetivas oferecidas pela Leica Microsystems são definidas por planos focais posteriores fixos (consulte a ilustração). O código do plano focal posterior da objetiva serve como uma referência para a seleção do prisma DIC do lado da objetiva correspondente, se necessário. Isso apresenta a vantagem de que várias objetivas podem ser usadas com um só prisma DIC.
A, B, C, D ou E = Plano focal posterior da objetiva
Lamínulas correspondentes
A lamínula é um componente importante do canal óptico e, portanto, deve atender aos mesmos padrões de qualidade óptica da objetiva. As objetivas de alta qualidade só podem atingir seu potencial pleno quando as lamínulas e os meio de imersão corretos são utilizados.
As objetivas a seco, de imersão em água e glicerina são extremamente sensíveis a desvios na espessura da lamínula. Objetivas com um anel de correção podem ser usadas para corrigir esses desvios.
Lamínulas e líquidos de imersão:
| Meio de imersão | Com ou sem lamínula | Tipo de lamínula 1,5 | Tipo de lamínula 1,5 H |
|---|---|---|---|
| Ar | NA < 0,30 | NA < 0,70 | NA > 0,70 |
| Água | NA < 0,60 | NA < 0,90 | NA > 0,90 |
| Tipo de imersão G (glicerina) | NA < 0,80 | NA < 1,10 | NA > 1,10 |
| Tipo de imersão N (Óleo) | NA < 0,90 | NA < 1,30 | – |
| Tipo de imersão F (Óleo) | NA < 0,90 | NA < 1,30 | NA > 1,30 |
Tabela 1: Lamínulas e líquidos de imersão
BD | para campo claro/campo escuro de luz incidente |
|---|---|
PH | objetiva de contraste de fase |
RC | objetiva de contraste de reflexão (somente com DM R) |
P, POL | baixa coloração, para polarização quantitativa |
/ | não para luz incidente, exceto fluorescência |
LMC | objetiva de contraste de modulação (somente com Leica DM IRB) |
Meio de imersão para objetivas
Para alta potência de resolução, a abertura numérica (NA) de uma objetiva precisa ser maior que 1. Isso também requer um meio de imersão com um índice de refração maior que 1, ou seja, diferente de ar. Os meios de imersão comuns são: óleo, água e glicerina. O meio de imersão que deve ser utilizado com uma determinada objetiva é indicado na objetiva.
Índices de refração
Todos os elementos opticamente relevantes (meio de imersão, lamínula, amostra) na frente da lente da objetiva têm uma influência importante na qualidade da imagem. De modo ideal, o índice de refração ao longo de todas essas camadas ópticas deve ser compatível com os índices de refração para o qual a objetiva foi concebida. Na realidade, isso é raramente possível, pois as amostras geralmente são heterogêneas, a espessura da lamínula não é tão precisa e a temperatura muda durante a aquisição da imagem.
Esses fatores devem ser sempre considerados ao escolher uma objetiva e o meio de imersão para uma determinada aplicação.
Quanto maior a abertura numérica da objetiva e mais profundas as estruturas de interesse no interior da amostra, mais importante será compatibilizar os índices de refração da amostra e o meio de imersão. Diferentes índices de refração levam a aberrações esféricas e distorções geométricas das estruturas. Isso resulta em uma perda de contraste e definição, bem como estruturas com aparência comprimida ou alongada.
Índices de refração de alguns meios de imersão importantes:
| Células cultivadas | 1.33 - 1.38 |
|---|---|
| Óleo tipo F | 1.52 |
| Glicerina | 1,45 (21 °C) – 1,46 (37 °C) para líquido de imersão Leica tipo G |
| Óleo de silicone | 1.41 |
| Água | 1.33 |
100% PBS pH 8,9 | 1.34 |
Mowiol | 1.46 |
| Bálsamo do Canadá | 1.52 |
| CLARITY | 1.45 |
| BABB | 1.54 |
| Lamínulas | 1.52 |
Óleo
O índice de refração do tipos N e F de imersão em óleo da Leica é de 1,518 (a 23 °C e 546 nm), ou seja, o mesmo que o vidro da coroa padrão (n=1,518). Para a aquisição de imagens multicolorida, a dispersão da imersão em óleo também é importante. Esse valor, normalmente chamado de número Abbe, deve corresponder ao número Abbe da objetiva para a qual foi concebida, ou ocorrerão aberrações cromáticas. Por exemplo o tipo N de imersão em óleo da Leica tem um número Abbe de 42,1, enquanto que o tipo F de imersão em óleo tem um número Abbe de 46, ideal para imagens de fluorescência. O tipo N não é adequado para imagens de fluorescência.
As objetivas de imersão em óleo são ideais para amostras que em um meio que corresponde ao índice de refração do óleo, ou seja, amostras incluídas em resina, bálsamo do Canadá ou glicerina-gel, ou que são geradas imagens perto da lamínula, ou seja, menos de poucos µm. Mais longe da lamínula, o brilho e a resolução da imagem se deterioram rapidamente, se o índice de refração não for compatível.
Para a geração de imagens ao vivo, ou seja, imagem em uma amostra aquosa. recomendamos enfaticamente o uso de imersão em água ou glicerina.
As objetivas de imersão em óleo com aberturas extremamente altas só proporcionam seu desempenho óptico pleno em um intervalo de temperatura relativamente estreito, visto que o índice de refração do óleo de imersão depende muito da temperatura. Quando maior a distância livre de trabalho maior a espessura da camada de óleo e, portanto, maior será o impacto das aberrações relacionadas à temperatura na qualidade da imagem. Esse efeito da temperatura muda linearmente com a distância livre de trabalho, mas depende da abertura numérica à potência de quatro.
Para ensaios em temperaturas que se desviam da temperatura ambiente, recomenda-se a imersão em água, uma vez que o índice de refração da água é significativamente menos dependente da temperatura é pode ser compensado, visto que as objetivas de imersão em água possuem anéis de correção.
Água
As objetivas de imersão em água são ideais para a observação de células vivas em meio aquoso, pois o índice de refração do meio de imersão e a amostra são uma correspondência mais próxima do que o óleo de imersão, por exemplo. No entanto, a água se evapora rapidamente a 37 °C. O Leica Water Immersion Micro Dispenser (microdistribuidor de imersão em água) automaticamente adiciona água durante um ensaio em execução para fornecer imersão em água estável.
Glicerina
Hoje em dia, a maioria das amostras fixadas como células cultivadas, fatias de tecido de amostras grossas, bem como embriões integrais são montados em Mowiol, Vectashield ou misturas semelhantes contento água e glicerina além de diversos produtos químicos, por exemplo, substâncias de preservação e antidesbotamento. Esses meios possuem índices de refração próximos ao de uma mistura de glicerina/água a 80%/20% (n=1,45). As objetivas para glicerina são excelentes para amostras montadas em qualquer meio com um índice de refração próximo de 1,45 – 1,46.
As objetivas Leica para imersão em glicerina oferecem um anel de correção para ajustar a óptica aos índices de refração variáveis provenientes de alterações da composição do meio de montagem ou de variações da espessura da lamínula ou da temperatura. A carta de aplicação nº 17 (abril de 2004) mostra uma descrição bastante detalhada das objetivas para imersão em glicerina e os efeitos das incompatibilidades do índice de refração.
Em sua maioria, as objetivas de multi-imersão (IMM) podem ser usadas para imersão em glicerina, bem como em água e óleo, conforme descrito abaixo.
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