Descubra novas aplicações combinando a microscopia confocal e lightsheet

Microscópio digital lightsheet STELLARIS DLS

A abordagem exclusiva do design da Leica Microsystems permite a aquisição de imagens confocais e lightsheet em um único sistema  que oferece uma iluminação suave de plano único. O design vertical do nosso sistema Digital LightSheet (DLS) permite que ele seja integrado, também como uma atualização, aos sistemas STELLARIS 5 e STELLARIS 8. Dessa forma, você pode se beneficiar de um microscópio lightsheet totalmente confocal e fácil de usar , tornando sua pesquisa mais versátil.

Imagem: Imagem composta de um embrião de peixe-zebra de 4 dias de idade com células endoteliais marcadas. Imagens de cortesia do Dr. Elvire Guiot, Centro de Imagens do IGBMC, Illkirch-Graffenstaden, França.

Mais versatilidade para sua pesquisa

A complementação do seu sistema STELLARIS 5 ou STELLARIS 8 com o DLS torna sua pesquisa mais versátil, permitindo que você, facilmente, capture imagens de diferentes tipos de amostras em três dimensões com manipulação simples das amostras e experimentos com diversas posições.

O módulo DLS foi projetado para aprimorar suas aplicações de aquisição de imagens de células vivas, aumentando a viabilidade celular graças à iluminação de plano único e aquisição rápida de imagens com uma câmera sCMOS. Além dos espécimes vivos, o DLS também permite adquirir imagens de amostras clarificadas, oferecendo mais flexibilidade para atingir suas metas de pesquisa.

O giro vertical – como o lightsheet é implementado em um confocal?

A microscopia light sheet geralmente requer uma configuração óptica dedicada em um sistema independente, no qual a iluminação e a objetiva de detecção são perpendiculares entre si. O DLS torna a microscopia lightsheet facilmente acessível. O dispositivo espelho TwinFlect exclusivo deflete a folha de luz iluminada em um ângulo de 90°. Essa melhoria permite a integração do caminho do feixe de iluminação e detecção no eixo vertical de cada sistema STELLARIS com suporte de microscópio invertido. Toda essa melhoria sem comprometer a funcionalidade confocal.

Aquisição de imagens de baixa fototoxicidade e de espécimes em 3D: Desenvolvimento do Drosophila melanogaster ao longo de seis horas. Sondagem: RFP sensível à luz. Renderização 3D. Pilha z de 150 µm, 30 s/pilha.

Conduza e documente observações de longo prazo

Adquirir imagens exige luz, mas muita luz pode danificar suas células. A microscopia lightsheet é o método de aquisição de imagens mais suave disponível até o momento, pois reduz fotolesão total causada por fototoxicidade e bleaching. Isso aumenta automaticamente a viabilidade da sua amostra. A Biologia do Desenvolvimento em particular se beneficia da aquisição de imagens lightsheet. A combinação de iluminação de baixa luz e aquisição de alta velocidade permite que você acompanhe organismos sensíveis em desenvolvimento, como um embrião de Drosophila, por longos períodos, e entenda como tecido e órgãos se formam em tempo real e 3D.

Princípio da aquisição de imagens lightsheet

A microscopia lightsheet é uma maneira altamente adequada para capturar imagens de amostras sensíveis ou de processos biológicos rápidos, iluminando a amostra apenas em um único plano.

Como não há excitação fora de foco, os resultados fototóxicos podem ser reduzidos ao plano focal. Além disso, ao mover a amostra pelo lightsheet, você tem um corte óptico automático e pode adquirir imagens de espécimes em 3D.

Aquisição de imagens em alta velocidade: Coração de peixe-zebra batendo, linha transgênica flik1::EGFP. Alinhamento pós-aquisição depois de gravação xytz. Velocidade de gravação: 120 quadros/segundo. Cortesia de Emily Steed, Vermot Lab, IGBMC Strasbourg, França.

Aquisição rápida de imagens com excelente resolução

Observar processos biológicos rápidos e periódicos em 3D, durante um período prolongado de tempo, como o batimento de um coração de peixe-zebra, pode ser desafiador sem a velocidade e resolução certas das imagens. Com o módulo DLS, você pode escolher entre duas câmeras sCMOS de última geração para aquisição rápida de imagens com excelente resolução, ambas totalmente integradas no Assistente LAS X LightSheet.

7,5 horas de gravação time-lapse de micro esferoide epitelial mamário em cultura em 3D. Dados de cortesia do intelligent imaging group (B. Eismann/C. Conrad) na BioQuant/DKFZ Heidelberg, Alemanha.

Explorando culturas de células 3D, em várias posições de só uma vez

A aquisição eficaz de imagens de culturas celulares em 3D, como organoides ou esferoides, representa uma nova série de desafios devido aos seus grandes volumes. Os organoides podem ser fixados, imunomarcados e estudados usando técnicas de clarificação, mas também utilizados em tempo real para estudar processos dinâmicos. A investigação dessas amostras com DLS é simples, graças aos fluxos de trabalho definidos, fornecendo informações significativas sobre processos celulares e moleculares. O DLS é bastante adequado para atender às necessidades de preparações clarificadas ou vivas, dando a você o benefício de estudar culturas celulares 3D que oferecem condições mais fisiologicamente relevantes em comparação com a cultura de células 2D em células aderentes.

Descubra o fluxo de trabalho completo de biologia celular 3D  com a microscopia lightsheet digital.

Um sistema lightsheet para amostras vivas e clarificadas

A microscopia profunda de tecidos é difícil devido à opacidade dos tecidos biológicos. É aqui que um número cada vez maior de protocolos de clarificação de tecidos entra em jogo, mas eles podem ser um desafio para muitos sistemas de aquisição de imagens.

O módulo DLS não apenas fornece resultados excepcionais com amostras em tempo real, mas também pode adquirir imagens submetidas a várias técnicas de clarificação diferentes. Com o DLS, você pode escolher entre várias objetivas de detecção e quadros de montagem que permitem a visualização de detalhes estruturais dentro de tecidos e organismos compensados.

Condições de aquisição de vídeo:

  • Objetiva de detecção HC APO L10x/0,30 W DLS
  • tamanho da imagem: 1,39 mm x 2,04 mm (blocos de 2x3)​
  • Pilha Z:1,5 mm de espessura (tamanho de passo de 2 um, 745 quadros)​
  • Tempo de aquisição: 5 min 37 seg​
  • Excitação: 514 nm
  • Emissão: Passagem longa LP514 nm, 6 ms de tempo de exposição​

Córtex cerebral e hipocampo de fatia cerebral de camundongo Thy1-YFP-H adulto compensada com o SeeDB2G. Imagens de cortesia do Dr. Meng-Tsen Ke e Dr. Takeshi Imai, RIKEN Center, Kobe, Japão.

Esse exemplo demonstra a vantagem do confocal combinado com DLS. Um embrião de peixe-zebra transgênico foi rotulado para visualizar macrófagos envolvidos nas respostas imunológicas. Para investigar seu comportamento após o ferimento, um laser confocal foi usado para criar uma ferida (seta) e, depois, um filme em time-lapse foi gravado. O vídeo mostra a reação dinâmica das células ativadas que agora estão migrando para a lesão, acionando o processo de cicatrização. Nesse caso, a mudança para DLS permite a aquisição suave de imagens celulares vivas do peixe-zebra. 

Beneficie-se de muitas aplicações adicionais

Nosso módulo lightsheet é mais do que um complemento funcional ao seu confocal. O STELLARIS e o DLS agem em sinergia para expandir as opções da sua pesquisa. Por exemplo, você pode manipular suas amostras usando a tecnologia confocal e, em seguida, adquirir imagens com DLS.

Isso é feito de forma simples, alternando entre o modo confocal e lightsheet no software LAS X. Dessa forma, a fotoconversão ou experimentos de fotomanipulação com observações suaves e subsequentes de longo prazo se tornam fáceis e convenientes.

Preparação familiar de amostras

Devido à configuração experimental vertical do DLS, você pode manter sua preparação de rotina das amostras. As amostras são montadas em placas de petri convencionais com fundo de vidro e são acessíveis diretamente. Você pode até mesmo fazer a triagem de várias amostras em experimentos de multiposicionamento. Utilizando a automação da platina do confocal, imagens de vários espécimes podem ser adquiridas em uma configuração experimental. Qual é o único pré-requisito? Um pouco de espaço para os espelhos TwinFlect em cada lado da amostra.

Preparação de amostra para DLS. Os espécimes são inseridos em ágar nas placas de petri com fundo de vidro. O excesso de ágar precisa ser removido para abrir espaço para o espelho TwinFlect.

Ferramentas de manipulação adicional das amostras

Uso de capilares de vidro em forma de U para montagem da amostra

Os capilares de vidro em formato de U estão disponíveis em dois tamanhos diferentes. Dessa forma, eles se encaixam em diferentes espelhos TwinFlect e podem servir como suportes ideais para posicionar sua(s) amostra(s). 
Informações adicionais

Uso de um dispositivo de rotação para composição da amostra DLS

Com um índice de refração de 1.338, tubos FEP são frequentemente usados para a composição de amostras imersas em soluções aquosas. Para alinhar perfeitamente a amostra para a aquisição de imagens, um dispositivo de rotação foi projetado para ajustar o ângulo de visualização.
Informações adicionais

Uso de estruturas de montagem para preparação de amostras

Os quadros de suporte da Leica, mostrados aqui, oferecem um importante benefício para a preparação de amostras, necessária para a aquisição de imagens DLS: Eles permitem a preparação de um número maior de amostras. Podem ser usados conjuntamente com reagentes potencialmente nocivos, como BABB (álcool benzílico benzil benzoato).
Informações adicionais

Conjunto de quadros de montagem (suporte de amostras retangular de 24 x 50 mm + suporte de amostras redondo com diâmetro de 30 mm)

Lightsheet com benefícios confocais

Graças à integração perfeita do DLS, suas aquisições de imagens de formato leve se beneficiam das inovações técnicas do seu sistema STELLARIS. 

Sempre o laser certo

Todos os lasers visíveis do seu STELLARIS confocal estão prontos para serem usados para a aquisição de imagens lightsheet. Uma alta flexibilidade na escolha do marcador certo para seus experimentos lightsheet é possível com as linhas opcionais de laser de diodo, bem como com os lasers de luz branca do STELLARIS next generation. Com o STELLARIS 8, agora você pode até mesmo desbloquear a imagem de corantes de infravermelho proximal.

Sempre o scanner certo

Em sistemas STELLARIS equipados com um scanner  em tandem, é possível escolher entre o scanner ressonante ou o scanner  de campo de visão (a 1400 Hz) para gerar a lightsheet digitalizada. Gerar a lightsheet com o scanner ressonante produz tempos de permanência de pixel menores, o que é benéfico para uma aquisição ainda mais suave de imagens.

Design de software orientado ao fluxo de trabalho

O software LAS X orienta os usuários passo a passo pelo registro e avaliação de dados. O design orientado ao fluxo de trabalho ajuda a usar o instrumento de maneira mais eficiente. Uma rotina de calibração conveniente estabelece o lightsheet com precisão.

A iluminação em ambos os lados da amostra vem do design: cada um dos dois espelhos opostos do TwinFlect pode ser direcionado pelo scanner para superar áreas mais escuras. Para imagens nítidas com um amplo campo de visão, você pode mesclar as duas imagens usando a opção de fusão on-line ou off-line do Assistente LightSheet no software LAS X.

Adapte o LAS X às suas necessidades com pacotes de software adicionais. O módulo de visualização LAS X 3D oferece novas maneiras de interagir com seus dados 3D por meio de cortes intuitivos, renderização rápida e visualização estereoscópica. Experimentos de aquisição em blocos permitem observar áreas amplas. Experimentos de localização Mark & Find permitem que você observe várias regiões de interesse em uma configuração de posições múltiplas.

Óptica superior

Objetivas superiores para uma ampla gama de aplicações é  uma das características da Leica Microsystems. O coração de nosso  sistema que gira o lightsheet verticalmente é formado pelas  objetivas e o dispositivo de espelho TwinFlect.

Com a opção de diferentes objetivas de iluminação, você pode moldar o lightsheet de acordo com os requisitos de seus experimentos.

Para  revelar os detalhes mais refinados, tenha um campo maior de  visão ou se adapte ao índice de refração de seu meio de aquisição de imagens. Você pode escolher a objetiva de detecção ideal a partir de um número crescente de opções.

Objetiva Aquisição de imagens de células vivas Reagentes de limpeza à base de açúcar Compatível com limpeza BAAB
FLUOTAR C 25x/0,95 W  Sim Não Não
APO C 20x/0,5 W Sim Não Não
Fluotar L 16x/0,6 IMM Sim Sim Sim
APO L 10x/0,3 Sim Sim Não
5x/0,15 IMM Sim Sim Sim

Tratamento conveniente de dados

Observar processos em 3D e durante longos períodos de tempo gera uma quantidade enorme de dados. Várias ferramentas implementadas no software LAS X ajudam a gerenciar seus dados de maneira conveniente. A ferramenta de fusão on-line oferece a opção de manter os dados originais ou  ganhar espaço no disco, salvando apenas a imagem mesclada. Seus dados são armazenados automaticamente durante a aquisição. O carregamento inteligente facilita a análise de dados, dando-lhe acesso direto aos pontos de tempo ou pilhas z de interesse em grandes conjuntos de dados com time-lapse. Você pode compilar suas etapas de pós-processamento desejadas em uma pipeline processada automaticamente.

Condições ambientais ideais

Uma câmara climática controlada por software mantém as condições ambientais mais adequadas aos seus espécimes. Os usuários obtêm controle total das condições experimentais com o módulo de controle ambiental LAS X. Os dados ambientais registrados podem ser monitorados durante o experimento. Todas as condições ambientais podem ser definidas em uma interface; por exemplo, você pode executar perfis de temperatura para experimentos de choque térmico.

Escolha entre uma câmara ambiental ou soluções de incubação em cima da platina.

Interessado em saber mais?

Fale com nossos especialistas. Ficaremos felizes em responder todas as suas dúvidas e preocupações.

Fale conosco

Você prefere consultoria pessoal?

Você encontrará uma lista mais detalhada de todos os contatos aqui.

Related Products

STELLARIS - Plataforma de microscopia confocal

STELLARIS

Com a plataforma confocal STELLARIS, reinventamos a microscopia confocal para aproximá-lo da verdade.
Seção histológica de olho de gato. A aquisição de imagens confocais simultâneas espectrais (em cinza) e FLIM (em cores) revela o contraste em função do tempo de vida. Aquisição e visualização usando STELLARIS 8 FALCON e o software LAS X.

STELLARIS 8 FALCON

O contraste é nítido. Aquisição de imagens do tempo de vida em um instante.