Etiquetado de objetivos

Los objetivos Leica se codifican y etiquetan de forma diferente según su tipo.

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Sistema HC de Leica Microsystems

El sistema Leica HC (Harmonic Compound System) comprende los componentes ópticos que se han combinado para crear imágenes óptimas y que participan en la corrección de aberraciones ópticas: objetivos, oculares, lentes de tubo, adaptadores para cámara y TV.

Para la corrección de ciertas aberraciones ópticas, el microscopio se considera un sistema completo. La aberración esférica, la coma y la aberración cromática axial se corrigen mejor en el lugar en el que se originan, es decir, en el componente concreto. La aberración cromática lateral y el astigmatismo se corrigen en paralelo en el objetivo, la lente de tubo y el ocular.

Por tanto, el resultado óptimo de la imagen se obtiene mediante la combinación de correcciones.

HC = El objetivo está incluido en el sistema HC.

HCX = El objetivo también es compatible con ópticas anteriores (óptica Delta 1991-1997)

El sistema HC garantiza

  • dimensiones de acoplamiento mecánico y óptico equilibradas,
  • una alineación equilibrada de todos los componentes del sistema óptico,
  • soluciones técnicas equilibradas y fiables,
  • un rendimiento óptico superlativo con una tecnología de fabricación progresiva.

Aumento del objetivo

Cada objetivo está etiquetado con su aumento, por ejemplo 5x o 100x. sin embargo, el aumento del objetivo no determina por sí solo el aumento general del microscopio, sino que se obtiene a partir del aumento del objetivo multiplicado por el aumento del ocular (para lentes de tubo 1x).

Ejemplo:

objetivo 40x x oculares 10x = 400x de aumento total.

Sin embargo, hay que mencionar que cuanto mayor sea el aumento del objetivo, menor será el campo visible del objeto.

Numerical Aperture

The numerical aperture (NA or A) of the objective is a key parameter for the optical image and determines the resolving power of the objective and the brightness of the image. It is defined by the sine of the half aperture angle a of the lens and the refractive index n of the immersion medium. According to this definition, the larger the numerical aperture, the more narrow the focal spot and hence the higher the resolving power.

The objectives are labeled with their magnification, followed by the particular NA value, for instance 10x/0.40 or 63x/1.40. The numerical aperture of the objective can be changed by using iris diaphragm objectives.

The term 'numerical aperture’ is explained in detail in the Leica Science Lab article: "Beware of "Empty" Magnification"

Iris Diaphragm

By using iris diaphragm objectives the numerical aperture of the objective can be changed. This is especially useful for widefield microscopy. If the iris diaphragm is closed, the numerical aperture and resolution are reduced but the depth of field is increased. If the iris diaphragm is opened again, the numerical aperture is increased, the resolution is increased, but the depth of field is decreased. An objective can also be used as a darkfield objective by narrowing the aperture.

Iris diaphragm objectives are labeled with the range within which the numerical aperture can be adjusted, for instance 1.4 – 0.7. 

The physical relationship between aperture, resolving power and depth of field is shown in the graph. A small aperture produces low resolution but large depth of field. A high aperture means better resolution but less depth of field. 

Linear correlation between aperture and resolution (green), respectively exponential correlation between aperture and depth of field (red)

Correction Collar

The performance of high-resolution objectives is optimal when the refractive indices of the specimen and all intermediate optical media match the values for which the objective is designed. Changes in coverglass thickness and temperature as well as inhomogeneous, thick specimens introduce refractive index mismatches. This causes deterioration of the point-spread function, geometric distortion, and chromatic aberration. These effects limit penetration depth, contrast, and intensity of the microscope images.

Immersion oil traditionally has a refractive index close to standard crown glass. Oil immersion objectives are designed for the refractive index of this oil. They are optimal when working close to the coverglass or with samples embedded in a medium with a refractive index close to that of immersion oil. For samples with refractive indices deviating from this value special objectives are offered. Most common are water immersion objectives, and glycerol immersion objectives. Water and glycerol immersion objectives are very sensitive to changes in coverglass – introducing a changing thickness of a medium with refractive index mismatch – temperature, and deviations of the immersion medium or the sample itself. Therefore, water and glycerol immersion objectives with a higher NA have a correction collar to compensate for those differences.

The correction collar axially moves the central lens group and can be used to restore optimal image resolution and brightness. As manual adjustment of the correction collar requires time and experience and can disturb the sample, Leica offers water immersion objectives with a motorized correction collar.

CORR = Objective with correction collar

Distancia de trabajo extralarga

La zona accesible de la muestra suele estar restringida por colisiones del objetivo con el portamuestras, los bordes de una placa multipocillo o el equipo adicional, por ejemplo, en la adquisición de imágenes intravitales o para electrofisiología. Los objetivos con una distancia de trabajo extralarga permiten también adquirir imágenes de los bordes de dichas muestras sin restricciones.

La adquisición de imágenes de tejidos profundos por excitación multifotónica o en tejidos clarificados también requiere objetivos con una distancia de trabajo extralarga para poder aprovechar completamente las ventajas ópticas de esas técnicas. De ahí que la necesidad de distancias de trabajo de más de un milímetro sea algo bastante común. Sin embargo, la apertura numérica del objetivo aún tiene que ser lo más grande posible para que las imágenes tengan una alta resolución.

Leica Microsystems ofrece una gama de objetivos secos o para inmersión en agua con una distancia de trabajo excepcionalmente larga. También están disponibles los objetivos de inmersión en agua con distancias de trabajo extralargas que presentan un gran ángulo de acceso y un frontal de cerámica inerte con conductividad eléctrica y térmica mínima para aplicaciones de electrofisiología.

L = Objetivo con distancia de trabajo extralarga

Objetivos de inmersión en agua con distancias de trabajo extralargas

HCX APO L 20x/1 W

HCX APO L 20x/1 W con montura M32 para utilizar con Leica DM6000 FS y CFS, FWD: 2 mm

HCX IRAPO L 25x/0,95 W

HCX IRAPO L 25x/0,95 W con montura M25 para utilizar con todos los microscopios, FWD: 2,5 mm

HCX APO serie L U-V-I

HCX APO serie L U-V-I, FWD: 2,2 – 3,6 mm

Plano retrofocal

Los objetivos Leica Microsystems están definidos por planos retrofocales fijos (ver ilustración).

El código del plano retrofocal del objetivo sirve como referencia para seleccionar el prisma DIC del objetivo correspondiente en caso necesario. Esto tiene la ventaja de que se pueden utilizar varios objetivos con un solo prisma DIC.

A, B, C, D o E = Plano retrofocal del objetivo

Cubreobjetos adecuados

El cubreobjetos es un componente importante de la trayectoria óptica y, por tanto, debería cumplir los mismos estándares de calidad óptica que el objetivo. Los objetivos de alta calidad sólo pueden ofrecer todo su potencial si se utilizan un medio de inmersión y cubreobjetos corregidos.

Los objetivos secos, de agua y de glicerol son extremadamente sensibles a las desviaciones de grosor del cubreobjetos. Se pueden utilizar objetivos con un collar de corrección para corregir estas desviaciones.

para su uso con y sin cubreobjetos

0

para su uso sin cubreobjetos

0.17

para su uso con un cubreobjetos de 0,17 mm (DIN/ISO)

1.8Q

para su uso con ventanas de cristal de cuarzo de 1,8 mm sobre platinas térmicas

0-2

para su uso con cubreobjetos de cristal de 0-2 mm de grosor

Los grosores estándar de cubreobjetos de cristal disponibles son:

N.º 1

0.13mm-0.17mm

N.º 1.5

0.16mm-0.19mm

N.º 1.5H

0.17mm +/-0.005mm

El tipo de cubreobjetos que se requiere para lograr un resultado óptimo depende del medio de inmersión y de la apertura numérica (NA): Se puede seguir la Tabla 1 como regla general.

Cubreobjetos y líquidos de inmersión:

Medio de inmersiónCon o sin cubreobjetosCubreobjetos tipo 1.5Cubreobjetos tipo 1.5 H
AireNA 0,30NA 0,70NA 0,70
AguaNA 0,60NA 0,90NA 0,90
Tipo de inmersión G (glicerol)NA 0,80NA 1,10NA 1,10
Tipo de inmersión N (aceite)NA 0,90NA 1,30
Tipo de inmersión F (aceite)NA 0,90NA 1,30NA 1,30

Tabla 1: Cubreobjetos y líquidos de inmersión

Métodos de contraste

Los métodos de contraste hacen visibles los cambios de fase que de otro modo son invisibles para el ojo humano, lo que permite la observación de muestras vivas no coloreadas.

Los objetivos especialmente adecuados para métodos de contraste específicos están etiquetados en consecuencia.

BD

para campo claro/campo oscuro de episcopía

PH

objetivo de contraste de fases

RC

objetivo de contraste de reflexión (sólo con DM R)

P, POL

baja tensión, para polarización cuantitativa

/

no adecuado para episcopía, excepto fluorescencia

LMC

objetivo de contraste de modulación (solo con Leica DM IRB)

Medios de inmersión para objetivos

Para una alta potencia de resolución, la apertura numérica (NA) de un objetivo debe ser mayor de 1. Esto también requiere un medio de inmersión con un índice de refracción mayor de 1, es decir, que no sea el aire. Los medios de inmersión comunes son aceite, agua y glicerol. El medio de inmersión que debe utilizarse con cada objetivo concreto se indica en el objetivo.

Multiinmersión

Los objetivos adecuados para utilizar con múltiples líquidos de inmersión, es decir, aceite, agua y glicerol, se pueden utilizar con el medio de inmersión óptimo para una amplia variedad de muestras.

Objetivos multiinmersión:

  • HC PL APO 10x/0,40 IMM CS
  • HC PL APO 20x/0,75 IMM CS2

ACEITE

Aceite de inmersión estándar DIN/ISO

W

Agua

GLYC

Glicerol

IMM

Cualquier otro o más de un medio de inmersión

Índices de refracción

Todos los elementos con relevancia óptica (medio de inmersión, cristal, cubreobjetos, muestra) que se colocan delante de la lente frontal del objetivo tienen una influencia importante en la calidad de la imagen. Lo ideal sería que el índice de refracción de todas estas capas ópticas coincidieran con los índices de refracción para los que fue diseñado el objetivo. En realidad, esto es casi imposible ya que con frecuencia las muestras no son homogéneas, el grosor del cubreobjetos no es tan preciso y durante la adquisición de la imagen tienen lugar cambios de temperatura.

Estos factores deben tenerse en cuenta al escoger un objetivo y un medio de inmersión para una aplicación concreta.

Cuanto mayor sea la apertura numérica del objetivo y más profundas las estructuras de interés dentro de la muestra, más importante es que coincidan los índices de refracción de la muestra y el medio de inmersión. Las diferencias en los índices de refracción provocan aberraciones esféricas y distorsiones geométricas de las estructuras. El resultado es una pérdida de contraste y definición, así como estructuras que parecen comprimidas o alargadas.

Índices de refracción de algunos medios de inmersión importantes:

Cultivos de células

1.33 - 1.38

Tipo de aceite F

1.52

Glicerol

1.45 (21°C) - 1.46 (37°C) for Leica immersion liquid type G

Aceite de silicona

1.41

Agua

1.33

100% PBS pH 8,9

1.34

Mowiol

1.46

Bálsamo de Canadá

1.52

CLARITY

1.45

BABB

1.54

Cubreobjetos

1.52

Aceite

El índice de refracción del aceite de inmersión Leica de tipo N y tipo F es 1,518 (a 23 ºC y 546 nm), es decir, el mismo que el vidrio sosa (n=1,518). Para la adquisición de imágenes multicolor también es importante la dispersión del aceite de inmersión. A esto se le suele llamar número Abbe y debe coincidir con el número Abbe para el que fue diseñado el objetivo porque, si no es así, aparecen aberraciones cromáticas. Por ejemplo, el aceite de inmersión Leica de tipo N tiene un número Abbe de 42,1, mientras que el aceite de inmersión tipo F tiene un número Abbe de 46, óptimo para la adquisición de imágenes de fluorescencia. El tipo N no es adecuado para la adquisición de imágenes de fluorescencia.

Los objetivos de inmersión en aceite son ideales para las muestras que están en un medio que coincide con el índice de refracción del aceite, es decir, muestras fijas clásicas embebidas en resina, bálsamo de Canadá o glicerol-gelatina, o que se adquieren cerca del cubreobjetos, es decir, a menos de unos pocos µm. Lejos del cubreobjetos, el brillo y la resolución de la imagen se deteriora rápidamente si los índices de refracción no coinciden.

Para la adquisición de imágenes de células vivas, es decir, en una muestra acuosa, recomendamos encarecidamente el uso de inmersión en agua o glicerol.

Los objetivos de inmersión en aceite con aperturas extremadamente elevadas solo ofrecen un rendimiento óptico completo en un intervalo de temperatura relativamente pequeño, ya que el índice de refracción del aceite de inmersión depende en gran medida de la temperatura. Cuanto más larga es la distancia de trabajo, más gruesa es la capa de aceite, y por tanto, mayor es el impacto de las aberraciones relacionadas con la temperatura sobre la calidad de la imagen. Este efecto de temperatura cambia linealmente con la distancia de trabajo, pero depende de la apertura numérica elevada a la cuarta potencia.

Para experimentos a temperaturas distintas a la temperatura ambiente, se recomienda la inmersión en agua, ya que el índice de refracción del agua depende considerablemente menos de la temperatura y se puede compensar, porque muchos objetivos de inmersión en agua tienen collares de corrección.

Augua

Los objetivos de inmersión en agua son perfectos para observar células vivas en medios acuosos, ya que el índice de refracción del medio de inmersión y el de la muestra son más parecidos que, por ejemplo, con aceite de inmersión. Sin embargo, el agua se evapora rápidamente a 37 °C. El microdispensador de inmersión en agua de Leica añade agua automáticamente durante un experimento en curso para una inmersión en agua estable.

Glicerol

Actualmente, la mayoría de las muestras fijas como cultivos de células, cortes de tejidos de muestras gruesas o embriones completos, se montan en Mowiol, Vectashield o mezclas similares que contienen agua y glicerol, además de diversas sustancias químicas, por ejemplo, antidecolorantes y sustancias de conservación. Estos medios tienen índices de refracción cercanos a los de una mezcla de 80 % de glicerol y 20 % de agua (n=1,45). Los objetivos de glicerol son excelentes para las muestras montadas en cualquier medio con un índice de refracción cercano a 1,45 – 1,46.

Los objetivos de glicerol de Leica ofrecen un collar de corrección para ajustar la óptica a los diversos índices de refracción que ocurren con los cambios de composición del medio de montaje o con las variaciones del grosor y la temperatura del cubreobjetos. En la Application Letter n.º. 17 (Ábrigo 2004) se muestra una detallada descripción de los objetivos de glicerol y los efectos de las discordancias entre índices de refracción.

La mayoría de objetivos multiinmersión (IMM) se pueden utilizar tanto para glicerol como para aceite de inmersión, tal y como se describe más adelante.

Inmersión en glicerol

Objetivo para inmersión en glicerol:

  • HC PL APO 63x/1.30 GLYC CORR CS2
  • HC PL APO 40x/1.25 GLYC CORR CS2
  • HC PL APO 40x/1.25 GLYC motCORR CS2
  • HC PL APO 93x/1.30 GLYC motC STED W
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