Imagen superpuesta que muestra el ojo de un pez cebra intacto y sin marcar. Verde: Dispersión Raman estimulada (SRS) de componentes lipídicos (a 2850 cm⁻¹). Rojo: Imagen SRS de componentes proteicos (a 2935 cm⁻¹). Azul: señales del segundo armónico, principalmente de la esclerótica y la córnea. Muestra proporcionada por Elena Remacha Motta y Julien Vermot, Instituto de Genética y Biología Molecular y Celular (IGBMC), Estrasburgo (Francia).

Aumente la potencia para obtener imágenes de objetivos inaccesibles con los métodos tradicionales

Mientras que los métodos tradicionales de microscopía de fluorescencia son herramientas de investigación de gran éxito, el tipo y el número de muestras que se pueden visualizar son limitadas. STELLARIS 8 CRS le ayuda a superar estas limitaciones:

  • Visualización directa de enlaces químicos para abordar eventos y estructuras que son en gran medida inaccesibles con los métodos tradicionales; 
  • Información de imágenes tridimensional que permite la observación de detalles finos incluso dentro de muestras 3D complejas; 
  • Excitación mínimamente perturbadora para estudios dinámicos con la muestra mantenida lo más proximo posible de las condiciones fisiológicas, desde imágenes de velocidad de vídeo hasta observaciones a largo plazo de muestras sensibles.

Estructuras de imagen y eventos sin necesidad de colorantes fluorescentes

El microscopio STELLARIS 8 CRS permite a los usuarios obtener imágenes y diferenciar estructuras y eventos utilizando sus propiedades químicas. De esta forma, puede proporcionar acceso a una gran cantidad de información bioquímica, metabólica y farmacocinética que es inaccesible a través de métodos tradicionales. 

El contraste de la imagen en CRS lo crean los estados vibracionales intrínsecos y característicos de las diferentes moléculas de la muestra. De este modo, no es necesario teñir la muestra, lo que elimina las desventajas de los métodos de obtención de imágenes a base de tintes, como el fotoblanqueo y los artefactos de teñido.

Las imágenes SRS multicolor revelan la distribución subcelular de un compuesto farmacológico marcado con Raman (amarillo, imágenes SRS a 2230 cm⁻¹), en el contexto de lípidos y proteínas endógenos dentro de una muestra celular sin teñir. Muestra por cortesía del Dr. Matthäus Mittasch, Dewpoint Therapeutics GmbH.

Imágenes tridimensionales en tejidos cerebrales: Pila en Z de un corte cerebral de ratón de 200 μm de grosor, que muestra imágenes SRS simultáneas de axones mielínicos (brillo) y fluorescencia de dos fotones de neuronas marcadas con Thy1-YFP (cian). Muestra por cortesía del Dr. Monika Leischner-Brill, Institute of Neuronal Cell Biology, TU München, Alemania.

Imágenes tridimensionales integradas para muestras 3D 

STELLARIS 8 CRS es perfecto para obtener imágenes de muestras 3D, como tejidos, organoides u organismos pequeños intactos, a resolución subcelular mediante el uso directo de sus propiedades químicas. La obtención de imágenes en 3D sin necesidad de procesamiento posterior es una propiedad integrada del CRS, gracias a la combinación de dos características: 

  • Las señales CRS se generan a través de un efecto óptico no lineal que tiene lugar exclusivamente dentro del volumen focal de los láseres de excitación, proporcionando información de imagen intrínsecamente tridimensional.
  • Los haces de láser de infrarrojo cercano utilizados para la excitación CRS se propagan a través de la muestra con una perturbación mínima, lo que permite obtener imágenes eficientes incluso dentro de muestras 3D intactas.

Imágenes de muestras en tiempo real lo más cerca posible de condiciones fisiológicas

La excitación altamente eficiente de los enlaces moleculares por CRS proporciona un contraste de imagen químicamente específico a velocidades sin precedentes. Permite la obtención de imágenes de muestras vivas a velocidades de vídeo. 

STELLARIS 8 CRS está equipado con un escáner en tándem que permite obtener imágenes convencionales y a alta velocidad de muchas morfologías de muestras. 

Además de la velocidad, una obtención amable de imágenes es esencial para preservar las muestras vivas durante la observación a largo plazo. El no precisar marcaje combinado con el uso de láseres cercanos al infrarrojo mantiene la fototoxicidad y los fotodaños en niveles mínimos. 

Investigación sin marcaje de la dinámica subcelular en un organoide intestinal pequeño vivo. La pelicula temporal de las señales SRS (2940 cm⁻¹) muestra proteínas endógenas y lípidos, lo que proporciona información sobre la organización de las células epiteliales y la dinámica de las gotas lipídicas en este sistema modelo. Muestra por cortesía del Dr. Ruslan Dmitriev, Universidad de Gante, Países Bajos.

Placas amiloide-β y depósitos lipídicos patológicos asociados visualizados en tejidos cerebrales no teñidos. El análisis espectroscópico muestra un enriquecimiento de los lípidos de la membrana y una reducción del colesterol en comparación con las estructuras cerebrales sanas cercanas, lo que proporciona una nueva ventana para estudiar las conexiones entre el metabolismo de los lípidos y la patología del Alzheimer. Muestra por cortesía del Dr. Martin Fuhrmann, Andrea Baral, Centro Alemán de Enfermedades Neurodegenerativas, Bonn.

Explore el potencial de la información morfoquímica y funcional en su experimento por imágenes

Para hacer frente a problemas complejos en las ciencias biológicas y la investigación médica fundamental, a menudo es necesario maximizar la información obtenida de sus muestras. Esto a menudo incluye la necesidad de obtener imágenes de objetivos no tradicionales, como los cambios en el metabolismo de los lípidos.

STELLARIS 8 CRS le proporciona un sistema totalmente integrado que le permite adquirir y correlacionar una amplia gama de contrastes bioquímicos y biofísicos, además de la intensidad de la fluorescencia confocal y la información del tiempo de vida para aprovechar al máximo su experimento.
 

Obtenga información sobre la composición bioquímica de su muestra 

La combinación de información morfológica y bioquímica puede ser crucial para comprender las funciones biológicas saludables y cualquier cambio causado por la enfermedad.

STELLARIS 8 CRS proporciona imágenes sin marcadores con contraste químico a una resolución espacial sin precedentes. Con el CRS, las funciones biológicas se pueden sondear en muchas escalas espaciales, que van desde los órganos subcelulares hasta grupos de células en un tejido o incluso estructuras patológicas que afectan al funcionamiento del tejido. 

Visualización de la composición bioquímica endógena de una rebanada de manzana fresca y sin tratar. (A) Marcos representativos de una pila de imágenes espectroscópicas SRS. (B) Espectros SRS de las regiones de interés mostradas en (A). Amarillo: piel más externa que consiste en una fase cerúlea de ácidos grasos saturados de cadena larga. Verde, rojo: capas cuticulares internas hechas de ácidos grasos insaturados de cadena corta. Azul, magenta: compuestos polifenólicos. Cian: paredes celulares de polisacáridos. Naranja: pigmentos carotenoides. (C) Resultado de la separación espectral de 8 colores que muestra las estructuras bioquímicamente distintas.
Las imágenes SRS sin marcadores revelan la arquitectura central de un modelo esferoide de cáncer de piel multicelular y revela la aparición de un fenotipo inesperado de células ricas en lípidos (células amarillas brillantes aisladas). Muestra por cortesía del Dr. Julia Klicks, Prof. Rüdiger Rudolf, Hochschule Mannheim (Alemania).

Muestra nuevas dimensiones relevantes para el desarrollo y la enfermedad

La visualización directa de los fenotipos celulares y los estados metabólicos es clave para comprender los procesos biológicos en la salud y la enfermedad. El procesamiento de muestras puede alterar estas propiedades, por lo que un enfoque sin marcadores puede ser la alternativa preferida.

Las imágenes CRS proporcionan las capacidades espectroscópicas que permiten un estudio detallado de su muestra en condiciones lo más cercanas posible a la vida real. 

Combinación de imágenes de fluorescencia confocal con imágenes químicas

Para obtener una visión sin precedentes de las múltiples dimensiones biológicas de su muestra, STELLARIS 8 CRS proporciona varios métodos de obtención de imágenes estrechamente integrados en el sistema confocal. Permiten la obtención de imágenes ópticas multimodales con contraste bioquímico, biofísico y molecular. 

  • Dispersión Raman Estimulada (SRS)
  • Dispersión Raman Coherente Anti-Stokes (CARS)
  • Fluorescencia monofotónica o multifotónica
  • Generación de segundo armónico (SHG)
  • Imágenes con láseres infrarrojos (IR), visibles (VIS) y ultravioletas (UV) en modo simultáneo o secuencial
     
Obtención de imágenes ópticas multimodales de osteogénesis en un explante de cráneo de ratón mediante una combinación de microscopía de fluorescencia confocal visible con imágenes químicas multicolor a través de SRS y contraste físico añadido a través de SHG. En una sola muestra, se visualiza la localización de osteoblastos, la deposición de fibras extracelulares de colágeno y la formación de mineral óseo. Además, las estructuras ricas en lípidos se observan predominantemente dentro de osteoblastos aislados dispersos a lo largo de las estructuras óseas en desarrollo. Muestra por cortesía de Jacqueline Tabler y Sebastian Bundschuh, MPI-CBG Dresde, Alemania.
Superior izquierda: Imagen de microscopio CARS de lípidos en un tejido cerebral, con regiones de materia blanca rica en lípidos y materia gris. Superior derecha: La imagen del tiempo medio de llegada de los fotones revela tiempos de llegada más cortos a partir de la materia blanca rica en lípidos y tiempos de llegada más largos a partir de la materia gris. Este resultado indica que las señales de CARS instantáneas van acompañadas de señales de autofluorescencia de 2 fotones con un teimpo de vida finito. Fila inferior: Separación basada en el tiempo de vida de las señales instantáneas de CARS y las señales de autofluorescencia con un tiempo medio de llegada de 1,9 ns. Derecha: Superponer imagen.

Explore nuevas posibilidades con imágenes vibracionales y de tiempo de vida  

Muchas muestras biológicas presentan emisión de fluorescencia, derivada de fluoróforos endógenos o de un marcaje fluorescente intencionado. Mientras que las señales SRS no se ven afectadas por la fluorescencia, las señales CARS pueden experimentar cierto grado de diafonía fluorescente.

Las herramientas TauSense de la plataforma STELLARIS pueden ayudar a resolver este problema. Mediante el uso de información basada en el tiempo de vida de la fluorescencia, puede separar señales de CARS instantáneas y señales de fluorescencia. 

Aumente su productividad con datos que se pueden cuantificar inherentemente 

STELLARIS 8 CRS ofrece toda la versatilidad y facilidad de uso disponibles con la plataforma STELLARIS. Esta integración le permite manejar una amplia gama de muestras difíciles y le ayuda a maximizar los beneficios de la obtención de imágenes CRS, incluida la obtención de datos inherentemente cuantificables a partir de enfoques de obtención de imágenes radiométricas y espectroscópicas. 

Imágenes SRS y espectros de dodecano (un hidrocarburo totalmente saturado, cian) y ácido linoleico (un ácido graso poliinsaturado, magenta) sumergidos en agua. La relación de intensidades entre 1660 cm⁻¹ y 1440 cm⁻¹ permite cuantificar la insaturación de lípidos.

Acceder a una imagen CRS con unos pocos clics usando la intuitiva interfaz de usuario ImageCompass.

Configuración sencilla de los experimentos con un sistema completamente integrado

Cada aspecto de su experimento está totalmente controlado a través de la interfaz de usuario ImageCompass, lo que ofrece un enfoque práctico e intuitivo de la microscopía CRS tanto para expertos como para principiantes.

Además, la integración del control láser CRS en ImageCompass permite a los usuarios pasar de imágenes unívocas a imágenes espectroscópicas o multimodales con tan solo unos clics. 

Navegue fácilmente por muestras grandes y complejas

LAS X Navigator es una potente herramienta que le permite pasar rápidamente de buscar imagen por imagen a disponer de una vista general completa de su muestra. La integración completa de los experimentos multiposición de CRS con Navigator le permite realizar escaneos de mosaicos completos de muestras grandes, proporcionando toda la información necesaria para elegir regiones de interés para investigaciones posteriores y más detalladas.

Obtención automatizada de imágenes de muestras de gran superficie: Aquí se muestra un barrido de mosaico de alta resolución de un corte cerebral completo de ratón. Una comparación de las regiones del tejido cortical correspondientes a partir de ratones criados en una dieta con alto contenido en grasa frente a una dieta normal revela la aparición de placas arteriales patológicas ricas en lípidos en una dieta con alto contenido en grasa, pero no en una dieta regular. Muestra por cortesía de Judith Leyh y el Prof. Ingo Bechmann, Universität Leipzig, Alemania.
Las imágenes espectroscópicas SRS proporcionan información detallada sobre la composición química de las estructuras cerebrales. Izquierda: Imagen de SRS que muestra estructuras de materia blanca ricas en lípidos sanas (arriba) y depósitos lipídicos patológicos alrededor de una placa de β amiloide (abajo a la izquierda). Derecha: Los espectros SRS muestran que los depósitos patológicos están enriquecidos con lípidos de membrana (sofingomyelina, fosfatidilcolina) en comparación con la materia blanca más rica en colesterol.

Información cuantificable a partir de imágenes hiperespectrales o ratiométricas

Inspirado en los enfoques desarrollados por la comunidad de espectroscopia Raman, el CRS permite obtener imágenes radiométricas y espectroscópicas que proporcionan información reproducible y cuantificable sobre la composición química de la muestra. Estas herramientas básicas de cuantificación están integradas en el software LAS X.

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