Añada versatilidad a sus investigaciones

Complementar su sistema STELLARIS 5 o STELLARIS 8 con DLS hace que su investigación sea más versátil, permitiéndole crear fácilmente imágenes de diferentes tipos de muestras en tres dimensiones con una sencilla manipulación de las muestras y con experimentos de multiposición.

El módulo DLS está diseñado para mejorar sus aplicaciones de obtención de imágenes de células vivas, aumentando la viabilidad de las células gracias a la iluminación de un solo plano y la obtención rápida de imágenes con una cámara sCMOS. Además de muestras vivas, DLS también permite obtener imágenes de muestras transparentadas para que tenga más flexibilidad para alcanzar sus objetivos de investigación.

El giro vertical: ¿cómo se consigue la lámina de luz en microscopía confocal?

La microscopía con lámina de luz suele requerir una instalación óptica específica en un sistema independiente, en el que la iluminación y la detección del objetivo son perpendiculares entre sí. El DLS facilita el acceso a la microscopía óptica de lámina de luz. El exclusivo dispositivo de espejo TwinFlect desvía la lámina de luz en un ángulo de 90°. Esta mejora permite integrar la trayectoria del haz de iluminación y detección en el eje vertical de cada sistema STELLARIS con estativo de microscopio invertido. Toda esta mejora se logra sin comprometer la funcionalidad confocal.

Fototoxicidad baja e imágenes en 3D de las muestras: Desarrollo de Drosophila melanogaster durante seis horas. Sonda: RFP fotosensible. Representación 3D. Pila z de 150 µm, 30 s/pila.

Realizar y documentar observaciones a largo plazo

La luz es necesaria para obtener imágenes, pero en exceso puede dañar las células. La microscopía de lámina de luz es el método de obtención de imágenes menos lesivo hasta la fecha, ya que reduce los fotodaños generales por fototoxicidad y decoloración. Esto aumenta automáticamente la viabilidad de las muestras. Especialmente la biología del desarrollo se beneficia de la obtención de imágenes de lámina de luz. La combinación de iluminación de baja intensidad de luz y la adquisición a alta velocidad permite seguir organismos sensibles y en desarrollo, como un embrión de Drosophila, durante largos periodos de tiempo, y comprender cómo se forman los tejidos y los órganos en tiempo real y en 3D.

Principio de obtención de imágenes con lámina de luz

La microscopía de lámina de luz es una forma muy adecuada de obtener imágenes de muestras sensibles o procesos biológicos rápidos al iluminar la muestra en un único plano.

Dado que no hay excitación fuera de foco, los elementos fototóxicos se pueden reducir al plano focal. Además, al mover la muestra a través de la lámina de luz, se obtiene automáticamente un seccionamiento óptico y se pueden obtener imágenes de las muestras en 3D.

Obtención de imágenes a alta velocidad: Latido del corazón de un pez cebra, línea transgénica 1::EGFP. Alineación posterior a la adquisición tras la grabación de xytz. Velocidad de grabación: 120 imágenes/segundo. Cortesía de Emily Steed, Vermot Lab, IGBMC, Estrasburgo, Francia.

Rápida adquisición de imágenes con una resolución excelente

Observar procesos biológicos rápidos y periódicos en 3D durante un periodo de tiempo prolongado, como el latido del corazón de un pez cebra, puede ser difícil sin la velocidad y resolución de imagen correctas. Con el módulo DLS, es posible elegir entre dos cámaras sCMOS de vanguardia para obtener rápidamente imágenes con una resolución excelente, ambas totalmente integradas en el asistente LAS X LightSheet.

Grabación en 3D de 7,5 horas de microesferoides epiteliales mamarios cultivados. Datos por cortesía del grupo de imágenes inteligentes (B. Eismann/C. Conrad) en BioQuant/DKFZ Heidelberg, Alemania.

Exploración de cultivos celulares en 3D, múltiples posiciones a la vez

La obtención eficaz de imágenes de cultivos celulares en 3D, como organoides o esferoides, plantea nuevos desafíos debido a su gran volumen. Con las técnicas de transparentación se pueden fijar, inmunomarcar y estudiar los organoides, además de utilizarse vivos para estudiar procesos dinámicos. La investigación de estas muestras con DLS es sencilla gracias a los flujos de trabajo definidos y proporciona información significativa sobre los procesos celulares y moleculares. El DLS es adecuado para satisfacer las necesidades de preparaciones tanto transparentadas como vivas, lo que ofrece la ventaja de estudiar cultivos celulares en 3D en condiciones que son más relevantes fisiológicamente que los cultivos celulares en 2D en células adheridas.

Descubra el flujo de trabajo completo de biología celular en 3D  con la microscopía digital LightSheet.

Un sistema de lámina de luz para muestras vivas y transparentadas

La microscopía profunda de tejidos es difícil debido a la opacidad de los tejidos biológicos. Aquí es donde entra en juego el creciente número de protocolos de transparentación de tejidos, pero pueden suponer un reto para muchos sistemas de obtención de imágenes.

El módulo DLS no solo ofrece resultados sobresalientes con muestras vivas, sino que también puede mostrar imágenes de muestras que se han sometido a diversas técnicas de transparentación. Con DLS, es posible elegir entre varios objetivos de detección y soportes de montaje que permiten visualizar los detalles estructurales dentro de tejidos y organismos transparentados.

Condiciones de adquisición de vídeo s:

  • Detección objetiva HC APO L10x/0.30 W DLS
  • tamaño de la imagen: 1,39 mm × 2,04 mm (2 × 3 baldosas)​
  • Pila Z:1,5 mm de grosor (tamaño del paso de 2 um, 745 estructuras)​
  • Tiempo de adquisición: 5 min 37 s​
  • Excitación: 514nm
  • Emisión: LP 514 nm paso largo, tiempo de exposición de 6 ms​

Corteza cerebral e hipocampo de corte de cerebro de ratón adulto de Thy1-YFP-H transparentado con SeeDB2G. Imágenes cortesía de la Dra. Meng-Tsen Ke y el Dr. Takeshi Imai, Centro RIKEN, Kobe, Japón.

Este ejemplo demuestra la ventaja del confocal combinado con DLS. Se marcó un embrión de pez cebra transgénico para visualizar los macrófagos implicados en las respuestas inmunitarias. A fin de investigar su comportamiento ante una herida, se empleó un láser confocal para crear una herida (flecha) y, a continuación, se grabó pelicula temporal. El vídeo muestra la reacción dinámica de las células activadas que ahora migran a la herida y desencadenan el proceso de cicatrización. En este caso, el cambio a DLS permite obtener imágenes no dañinas de células vivas del pez cebra. 

Benefíciese de muchas aplicaciones adicionales

Nuestro módulo de lámina de luz es más que un complemento funcional para su sistema confocal. STELLARIS y DLS actúan sinérgicamente para ampliar las opciones de sus investigaciones. Por ejemplo, puede manipular muestras utilizando la tecnología confocal y luego obtener las imágenes con DLS.

Para ello, basta con cambiar entre el modo confocal y el modo de lámina de luz en el software LAS X. De este modo, los experimentos de fotoconversión o de heridas seguidas por observaciones a largo plazo se vuelven fáciles y prácticas.

Preparación habitual de muestras

Gracias a la configuración experimental vertical de DLS, es posible mantener la preparación habitual de muestras. Las muestras se montan en placas de Petri convencionales con fondo de vidrio y son directamente accesibles. Incluso cabe la posibilidad de cribar varias muestras en experimentos de varias posiciones. Utilizando la automatización de la platina XY confocal, se pueden obtener imágenes de varias muestras en una configuración experimental. ¿Cuál es el único requisito previo? Algo de espacio para los espejos TwinFlect a cada lado de la muestra.

Preparación de muestras para DLS. Las muestras están incluidas en agar sobre placas de Petri con fondo de vidrio. Debe retirarse el exceso de agar para dejar espacio para el espejo TwinFlect.

Herramientas adicionales para la manipulación de muestras

Uso de capilares de vidrio en forma de U para el montaje de muestras

Los capilares de vidrio en forma de U están disponibles en dos tamaños diferentes. De este modo, se adaptan a diferentes espejos TwinFlect y pueden servir como estructura óptima para colocar las muestras. 
Información adicional

Uso de un dispositivo de rotación para el montaje de muestras DLS

Con un índice de refracción de 1.338, los tubos FEP se utilizan a menudo para colocar muestras sumergidas en soluciones acuosas. Para alinear de forma óptima la muestra para la obtención de imágenes, se ha diseñado un dispositivo de rotación que ajusta el ángulo de visualización.
Información adicional

Uso de marcos de montaje para la preparación de muestras

Los marcos de montaje Leica que se muestran aquí ofrecen una gran ventaja en la preparación de muestras para la obtención de imágenes DLS: Permiten la preparación de un mayor número de muestras. Se pueden utilizar junto con reactivos potencialmente dañinos como BABB (alcohol bencílico y benzoato de bencilo).
Información adicional

Juego de marcos de montaje (portamuestras rectangular de 24 × 50 mm + portamuestras redondo con un diámetro de 30 mm)

Light-sheet con beneficios confocales

Gracias a la integración perfecta de DLS, las imágenes de lámina de luz se benefician de las innovaciones técnicas del sistema STELLARIS. 

Siempre el láser correcto

Todos los láseres visibles del sistema confocal STELLARIS están listos para su uso para la obtención de imágenes con lámina de luz. Gracias a las líneas láser de diodo opcionales y a los láseres de luz blanca de la nueva generación STELLARIS, es posible disponer de una gran flexibilidad a la hora de elegir la tinción adecuada para los experimentos con láminas de luz. Con STELLARIS 8, podrá incluso desbloquear la captura de imágenes de tinciones próximas al espectro infrarrojo.

Siempre el escáner correcto

En los sistemas STELLARIS equipados con un escáner en  tándem, puede elegir entre el escáner resonante o el escáner  de campo visual (a 1400 Hz) para generar la lámina de luz escaneada. Al generar la lámina de luz con el escáner resonante se consiguen tiempos más cortos de permanencia de píxeles, lo que resulta beneficioso para obtener imágenes menos dañinas aún.

Diseño de software orientado al flujo de trabajo

El software LAS X guía al usuario paso a paso por el registro y la evaluación de los datos. El diseño orientado al flujo de trabajo le ayudará a utilizar el instrumento de forma más eficiente. Un práctico procedimiento de calibración establece la lámina de luz con precisión.

El sistema está diseñado para iluminar la muestra por dos lados: cada uno de los dos espejos opuestos del TwinFlect puede ser dirigido por el escáner para superar áreas más oscuras. Para obtener imágenes nítidas con un campo de visión amplio, es posible fusionar las dos imágenes utilizando la opción de fusión en línea o fuera de línea del asistente LightSheet en el software LAS X.

Adapte LAS X a sus necesidades con paquetes de software adicionales. El módulo de visualización LAS X 3D ofrece novedosas formas de interactuar con los datos 3D mediante un recorte intuitivo, una representación rápida y una visualización estéreo. Los experimentos de escaneo en mosaico permiten observar grandes áreas. Con Mark&Find, es posible observar varias regiones de interés en una configuración multiposición.

Óptica superior

Los objetivos superiores para una amplia gama de aplicaciones son uno de los sellos distintivos de Leica Microsystems.  El núcleo del posicionamiento vertical de la lámina de luz en nuestro  sistema está formado por los objetivos y el dispositivo de espejos TwinFlect. 

Con la selección de objetivos de iluminación diferentes, puede dar forma a la lámina de luz en función de los requisitos de sus experimentos.

Para  revelar los detalles más precisos, tener un campo  de visión más amplio o adaptarse al índice de refracción del medio de la imagen, puede elegir el objetivo de detección óptimo de entre un número creciente de opciones.

Objetivo Imágenes de células vivas Reactivos de limpieza a base de azúcar Compatible con BAAB clearing
FLUOTAR L 25x/0,95 W  No No
APO L 20x/0,5 W No No
Fluotar L 16x/0.6 IMM
APO L 10x/0,3 No
5x/0,15 IMM

Cómoda gestión de datos

Observar procesos en 3D y durante largos periodos de tiempo genera grandes cantidades de datos. Varias herramientas implementadas en el software LAS X ayudan a que su gestión sea cómoda. La herramienta de fusión en línea le ofrece la opción de mantener los datos sin procesar o de  ganar espacio en disco guardando solo la imagen fusionada. Sus datos se almacenan automáticamente durante la adquisición. La carga inteligente facilita la revisión de los datos, ofreciéndole acceso directo a los puntos de tiempo o a las series en z de interés en conjuntos de datos grandes de adquisiciones temporales de gran tamaño. Puede compilar los pasos de posprocesamiento deseados en una cola de trabajo, que se procesa automáticamente.

Condiciones ambientales óptimas

Una cámara climática controlada por software mantiene las condiciones ambientales que mejor se adecúen a sus muestras. Los usuarios tienen un control total de las condiciones experimentales con el módulo LAS X Environmental Control. Los datos ambientales registrados pueden supervisarse durante el experimento. Todas las condiciones ambientales se pueden configurar en una sola interfaz, por lo que, por ejemplo, se pueden ejecutar perfiles de temperatura para experimentos de choque térmico.

Elija entre una cámara ambiental o soluciones de incubación sobre platina.

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