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Suivi des interactions moléculaires avec FLIM-FRET

La recherche moderne étudie la façon dont les molécules interagissent pour accomplir des tâches vitales. FLIM-FRET est la référence standard qui permet d’explorer ces interactions.

STELLARIS 8 FALCON établit un nouveau standard de vitesse pour les instruments FLIM.

Il permet les études FRET lors des événements cellulaires dynamiques. Vous pouvez acquérir et interpréter les données FRET dans vos expériences quotidiennes.

AMPc cagé dans des cellules HeLa exprimant le capteur EPAC mT2-dVenus FRET. Réponse EPAC à la libération de l’AMPc à médiation UV (zone centrale). Film enregistré à 4 images/seconde. Taille de l’image : 256 x 256 pixels. Échelle du graphique à barres de couleur (durée de vie) : ns. Avec l’aimable autorisation de Kees Jalink, Bram van den Broek, NKI Amsterdam.

Oscillations du calcium sous l’effet d’une stimulation par peptide activateur de thrombine. La réponse dans les cellules individuelles est enregistrée comme un changement dans la durée. Film enregistré à 4 images/seconde. Taille de l’image : 256 x 256 pixels. Échelle du graphique à barres de couleur (durée de vie) : ns. Avec l’aimable autorisation de Kees Jalink, Bram van den Broek, NKI Amsterdam.

Suivez les changements subtils et rapides grâce aux biosenseurs

Les biosenseurs sont de puissants indicateurs de l’activité métabolique, des mécanismes de signalisation, du pH et des modifications du microenvironnement.

Le STELLARIS 8 FALCON permet d’accéder aux informations contenues dans le temps de vie de la fluorescence, même pour des événements ultrarapides tels que la dynamique du potentiel de membrane. Ces informations complètent l’imagerie de l’intensité spectrale de la fluorescence et les modes TauSense fournis par le système STELLARIS 8.

Une imagerie métabolique plus fiable et plus sensible

L’autofluorescence peut poser problème dans l’imagerie conventionnelle. STELLARIS 8 FALCON STELLARIS 8 FALCON transforme l’autofluorescence en une information précieuse Vous pouvez désormais transformer l’autofluorescence en un rapporteur indiquant l’état métabolique, la différenciation des cellules et le développement du cancer.

En outre, STELLARIS 8 FALCON permet d’obtenir des images contrastées dans les tissus vivants, où le marquage par fluorescence est souvent non spécifique ou détruit les conditions physiologiques. 

Autofluorescence dans les cellules de mammifères dans des conditions non physiologiques (pH 8.5). Le signal est en corrélation avec les changements dans le pool endogène NAD/NADH. Le développement du stress oxydatif se traduit par une diminution du temps de vie de la fluorescence au fil du temps. Taille originale de l’image : 512 x 512 pixels. Échelle du graphique à barres de couleur (durée de vie) : ns.
Intensité
FLIM

Séparation des fluorophores au-delà des options spectrales.

Le marquage par fluorescence constitue le moyen standard de différencier les structures intracellulaires. La séparation spectrale est très puissante, mais parfois limitée lorsque les spectres d’émission sont trop proches.

Avec le STELLARIS 8 FALCON, vous pouvez exploiter tout le potentiel de l’imagerie de fluorescence résolue en temps de vie (FLIM) pour séparer différentes sondes fluorescentes en utilisant l’ajustement exponentiel (exponential fitting), l’ajustement des motifs (pattern fitting) et la nouvelle analyse phasor FLIM.

Image interactive : Structures du cytosquelette distinguées par le contraste de la durée de vie. Vimentine immunomarquée avec du fluor Alexa 555 (vert), et tubuline immunomarquée avec du fluor Alexa 546 (bleu). Les fluorophores sont spectralement très similaires, mais ils sont séparés à l’aide des informations sur la durée de vie de la fluorescence. Taille de l’image : 512 x 512 pixels.

Le STELLARIS 8 FALCON pour une imagerie rapide du temps de vie

Le microscope STELLARIS 8 FALCON surmonte la limitation de vitesse de la FLIM et ouvre la voie à des données à durée de vie rapide.

Jusqu’à présent, les informations fonctionnelles extraites des données par fluorescence résolue en temps de vie de processus rapides étaient difficiles à obtenir en raison des contraintes techniques de la FLIM. La vitesse d’acquisition de la FLIM était au moins 10 fois plus lente que l’enregistrement de l’intensité confocale.

Grâce à l’imagerie de contraste en temps de vie STELLARIS 8 FALCON, vous pouvez suivre les processus dynamiques dans les cellules au rythme approprié. Ces tâches sont rendues possibles grâce à une nouvelle technique de mesure du temps utilisant le TCSPC (Time-Correlated Single Photon Counting) ainsi que des algorithmes intelligents pour le traitement et l’analyse des données.

Note d’application dans Nature : Le SP8 FALCON : un nouveau concept d’imagerie en fluorescence résolue en temps de vie permettant la microscopie confocale à débit vidéo FLIM

Image à canal unique de perles fluorescentes (magenta) dans une solution contenant du fluor Alexa 555 (vert). La séparation des fluorophores basée sur le temps de vie de la fluorescence est possible à différentes vitesses, par exemple 16 ips (haut), 27 ips (débit vidéo, milieu), et 83 ips (ultra-rapide, bas). L’utilisation des informations sur le temps de vie pour la séparation des sondes est nettement plus avantageuse que l’intensité (échelle de gris). Les films montrent l’ajustement pixel par pixel des composants de la durée de vie. Taille de l’image : 512 x 64 pixels. Barre d’échelle : 10 µm.
Acquisition simple d’échantillons complexes. Image haute résolution d’une mosaïque d’embryons de souris composée de 722 tuiles de 190 mégapixels. Données de la microscopie en fluorescence résolue en temps FLIM avec quatre durées de vie caractéristiques, codées par couleur. Acquisition 1:23 h. Analyse 01:00 h.

Imagerie multimodale tout-en-un

La combinaison de la microscopie en fluorescence résolue en temps de vie avec d’autres fonctionnalités n’a jamais été aussi facile qu’avec le STELLARIS 8 FALCON. Jusqu’à présent, les chercheurs devaient faire face à un câblage complexe et à des tâches de transfert de fichiers lourds. Grâce à STELLARIS 8 FALCON, vous pouvez intégrer les informations de tout un temps de vie dans votre flux de travail confocal standard.

STELLARIS 8 FALCON est entièrement intégré dans le logiciel d’acquisition et d’analyse LAS X. Il peut enregistrer la FLIM dans quatre canaux spectraux simultanément et jusqu’à 10 canaux séquentiellement. Le STELLARIS 8 FALCON vous donne accès à un contraste à vie dans des piles 3D, des séquences en temps réel et même de grands formats de mosaïques.

LAS X NAVIGATOR vous permet d’étendre votre zone de visualisation jusqu’à 10 000 fois, et ainsi gagner un temps précieux pour identifier vos zones d’intérêt et étudier vos échantillons d’une manière inédite. 

Définition simple du temps de vie avec l’analyse Phasor

L’analyse avec le SP8 FALCON utilisant l’analyse phasor FLIM   fournit une visualisation 2D des composants de durée de vie. Avec le module PHASOR FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), vous pouvez suivre les changements micro environnementaux, sélectionner des composantes pour multiplexer le signal et déterminer l’efficacité FRET (Förster resonance energy transfer).

Cellules marquées avec Alexa555-Phalloidine et H2B mCherry. Séparation effectuée à l’aide du module Phasor FLIM. La représentation phasor montre clairement deux distributions. Courtoisie : Dr Martin Stöckl, Département de biologie, Université de Constance, Allemagne. 
Philosophie en 1 clic pour mieux vous concentrer sur votre science : STELLARIS 8 FALCON contrôlé par le logiciel LAS X.

Les résultats souhaités - en un clic.

Le logiciel LAS X permet de réaliser des microscopies en fluorescence résolue en temps réel FLIM en un seul clic et avec la même philosophie que l’imagerie spectrale de routine.

Même si vous utilisez la microscopie comme technique complémentaire, vous obtiendrez l’essentiel et commencerez l’imagerie immédiatement.

Des fonctions plus spécialisées sont accessibles sous forme de workflows et permettent l’automatisation pour une flexibilité optimale.

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