Scopri nuove applicazioni combinando la microscopia confocale con la microscopia light-sheet.

    Microscopio Digital Light Sheet STELLARIS DLS

    L'esclusivo approccio progettuale di Leica Microsystems consente di realizzare con un unico sistema immagini  di microscopia confocale e light-sheet ; che fornisce un'illuminazione delicata su singolo piano. Il design verticale del nostro sistema Digital LightSheet (DLS) consente di integrarlo, anche come aggiornamento, nei sistemi STELLARIS 5 e STELLARIS 8. In questo modo, potrai beneficiare di tutte le potenzialità di un microscopio confocale e un sistema light-sheet facile da usare  e rendere così la tua ricerca più versatile.

    Immagine: Mosaico di un embrione di Zebrafish di 4 giorni con marcatura delle cellule endoteliali.  Immagini gentilmente concesse dal Dott. Elvire Guiot, Centro imaging dell'IGBMC, Illkirch-Graffenstaden, Francia.

    Aggiungi versatilità alla tua ricerca

    Integrare il tuo sistema STELLARIS 5 o STELLARIS 8 con DLS renderà la tua ricerca più versatile, consentendoti di visualizzare facilmente diversi tipi di campioni in tre dimensioni con una gestione semplice dei campioni e di esperimenti multiposizione.

    Il modulo DLS è progettato per migliorare le applicazioni di live-cell imaging, aumentando la vitalità cellulare grazie all'illuminazione su singolo piano e all'acquisizione veloce con una fotocamera sCMOS. Oltre ai campioni vivi, il DLS consente anche di catturare immagini di campioni chiarificati, offrendo maggiore flessibilità per raggiungere gli obiettivi della tua ricerca.

    Rotazione verticale – In che modo il light-sheet viene integrato in un confocale?

    La microscopia light-sheet richiede di solito una configurazione ottica dedicata su un sistema indipendente, in cui gli obiettivi di illuminazione e rilevazione sono perpendicolari tra loro. DLS rende facilmente accessibile la microscopia light-sheet. L'esclusivo dispositivo a specchio TwinFlect deflette il foglietto di luce di illuminazione con un angolo di 90°. Questo miglioramento consente l'integrazione del percorso della luce di illuminazione e di rilevazione all'interno dell'asse verticale di ogni sistema STELLARIS costituito da uno stativo rovesciato. Tutto questo è stato implementato senza compromettere la funzionalità confocale.

    Bassa fototossicità e imaging dei campioni in 3D: Sviluppo di Drosophila melanogaster in sei ore. Sonda: RFP fotosensibile. Rendering 3D. Z stack da 150 µm, 30 sec/stack.

    Condurre e documentare osservazioni a lungo termine

    L'imaging richiede luce, ma una quantità eccessiva di luce può danneggiare le cellule. La microscopia light-sheet è il metodo di acquisizione più delicato attualmente disponibile, in quanto riduce la fototossicità e il photobeaching. Ciò aumenta automaticamente la vitalità del campione. La biologia dello sviluppo trae particolarmente beneficio dalla microscopia light-sheet. La combinazione di un bassa intensità luminosa in eccitazione con l'acquisizione ad alta velocità, consente di seguire organismi sensibili come l'embrione di Drosophila, durante il loro sviluppo, per lunghi periodi di tempo e comprendere così come si formano tessuti e organi in tempo reale e in 3D.

    Principio della microscopia light-sheet.

    La microscopia light-sheet è un metodo molto adatto per l'acquisizione di campioni sensibili o processi biologici rapidi, poichè permette di illuminare il campione su singolo piano.

    Poiché la luce di eccitazione illumina solo il piano di fuoco gli effetti di fototossicità sono ridotti al piano focale. Inoltre, spostando il campione attraverso il foglietto di luce, è possibile eseguire automaticamente il sezionamento ottico e acquisire immagini dei campioni in 3D.

    Imaging ad alta velocità: Cuore battente di Zebrafish, linea transgenica flik1::EGFP. Allineamento post-acquisizione dopo la registrazione xytz. Velocità di registrazione: 120 fotogrammi/secondo. Per gentile concessione di Emily Steed, Vermot Lab, IGBMC Strasbourg, Francia.

    Acquisizione rapida delle immagini con risoluzione eccellente

    Osservare processi biologici rapidi e periodici in 3D per un lungo periodo di tempo, come il battito di un cuore di Zebrafish, può essere difficile senza la giusta velocità e risoluzione dell'immagine. Con il modulo DLS è possibile scegliere tra due fotocamere sCMOS all'avanguardia per una rapida acquisizione delle immagini con una risoluzione eccellente, entrambe completamente integrate nel Wizard LAS X LightSheet.

    Time-lapse di 7,5 ore di micro sferoide epiteliale mammario in 3D. I dati sono forniti su gentile concessione del gruppo di imaging intelligente (B. Eismann/C. Conrad) presso BioQuant/DKFZ Heidelberg, Germania.

    Esplorando le colture cellulari 3D, più posizioni alla volta

    Acquisire in modo efficace colture cellulari in 3D, come organoidi o sferoidi, pone una nuova serie di sfide a causa dei loro elevati volumi. Gli organoidi possono essere fissati, marcati e studiati utilizzando tecniche di chiarificazione, ma possono anche essere utilizzati in vivo per studiare processi dinamici. L'analisi di questi campioni con il DLS è semplice grazie a flussi di lavoro definiti e fornisce informazioni significative sui processi cellulari e molecolari. DLS è adatto a soddisfare le esigenze di preparazioni sia chiarificate che in vivo, con il beneficio di poter studiare colture cellulari 3D che offrono informazioni fisiologicamente più rilevanti rispetto alle colture cellulari 2D sulle cellule in adesione.

    Scopri il flusso di lavoro completo della biologia cellulare in 3D  con la microscopia Digital Light Sheet.

    Un sistema light-sheet per campioni vivi e chiarificati

    Acquisire dei tessuti in profondità con un microscopio è difficile a causa dell'opacità dei tessuti biologici. È qui che entra in gioco il numero sempre crescente di protocolli di chiarificazione dei tessuti. Questi possono rappresentare una sfida per molti sistemi di imaging.

    Il modulo DLS non solo fornisce risultati eccezionali con campioni in vivo, ma è anche in grado di acquisire immagini di campioni che sono stati sottoposti a diverse tecniche di chiarificazione. Con DLS è possibile scegliere tra diversi obiettivi di rilevazione e supporti per il montaggio del campione che consentono la visualizzazione dei dettagli strutturali all'interno di tessuti e organismi chiarificati.

    Condizioni di acquisizione video:

    • Obiettivo di rilevazione HC APO L10x/0,30 W DLS
    • dimensione dell'immagine: 1,39mm x 2,04mm (mosaico 2x3 tiling)​
    • zstack: 1,5°mm di spessore (step size 2°um, 745 fotogrammi)​
    • Tempo di acquisizione: 5 minuti e 37 secondi​
    • Eccitazione: 514n
    • Emissione: LP514 nm passa alto, tempo di esposizione di 6 msec​

    Corteccia cerebrale e ippocampo della sezione di cervello di topo adulto Thy1-YFP-H chiarificati con SeeDB2G. Immagini su gentile concessione del Dott. Meng-Tsen Ke e del Dott. Takeshi Imai, RIKEN Center, Kobe, Giappone.

    Questo esempio dimostra il vantaggio del confocale combinato con DLS. È stato marcato un embrione di Zebrafish transgenico per visualizzare i macrofagi coinvolti nella risposta immunitaria. Per studiare il loro comportamento in seguito alla lesione, è stato utilizzato un laser confocale per creare una ferita (freccia) e successivamente è stato registrato un filmato time-lapse. Il video mostra la reazione dinamica delle cellule attivate che migrano verso la ferita, innescando il processo di guarigione. In questo caso, il passaggio a DLS consente l'imaging delicato delle cellule vive di Zebrafish. 

    Vantaggi derivanti da molte applicazioni aggiuntive

    Il nostro modulo light-sheet è più di un accessorio funzionale per il tuo confocale. STELLARIS e DLS si sinergizzano per ampliare le opzioni di ricerca. Ad esempio, è possibile manipolare i campioni utilizzando la tecnologia confocale e quindi acquisirli con DLS.

    Si può fare semplicemente passando dalla modalità confocale a quella light-sheet nel software LAS X. In questo modo, gli esperimenti di fotoconversione o di wounding con successiva e delicata osservazione a lungo termine diventano semplici e comodi.

    Ordinaria preparazione del campione

    Grazie alla configurazione sperimentale verticale del DLS, è possibile mantenere una preparazione dei campioni ordinaria. I campioni vengono montati in piastre Petri convenzionali con fondo in vetro e sono direttamente accessibili. È anche possibile esaminare diversi campioni in esperimenti multi-posizionamento. Utilizzando l'automazione del tavolino confocale, è possibile acquisire diversi campioni in un'unica configurazione sperimentale. Qual è l'unico prerequisito? Un po' di spazio per gli specchi TwinFlect su ciascun lato del campione.

    Preparazione del campione per DLS. I campioni sono inclusi in agar su piastre Petri con fondo in vetro. Occorre rimuovere l'agar in eccesso per fare spazio agli specchi TwinFlect.

    Strumenti aggiuntivi per la gestione dei campioni

    Utilizzo di capillari in vetro a forma di U per il montaggio dei campioni

    I capillari in vetro a forma di U sono disponibili in due diverse dimensioni. In questo modo si adattano a diversi specchi TwinFlect e possono servire come strutture ottimali per il posizionamento dei campioni. 
    Informazioni aggiuntive

    Utilizzo di un dispositivo di rotazione per il montaggio dei campioni DLS

    Con un indice di rifrazione di 1.338, i tubi FEP vengono spesso utilizzati per il montaggio di campioni immersi in soluzioni acquose. Per allineare in modo ottimale il campione per l'imaging, è stato progettato un dispositivo di rotazione per regolare l'angolo di visualizzazione.
    Informazioni aggiuntive

    Utilizzo di supporti di montaggio per la preparazione dei campioni

    I supporti di montaggio Leica qui mostrati offrono un notevole vantaggio per la preparazione dei campioni necessaria per eseguire l'imaging DLS: Consentono la preparazione di un maggior numero di campioni. Possono essere utilizzati con reagenti potenzialmente pericolosi come BABB (Benzyl Alcohol Benzyl Benzoate).
    Informazioni aggiuntive

    Set di supporti di montaggio (porta campioni rettangolare 24 x 50 mm + porta campioni tondo con diametro di 30 mm).

    Light-sheet con i vantaggi del confocale

    Grazie alla perfetta integrazione di DLS, le vostre immagini light-sheet traggono vantaggio dalle innovazioni tecniche introdotte con il sistema STELLARIS. 

    Sempre il laser giusto

    Tutti i laser visibili del confocale STELLARIS sono pronti per essere utilizzati per l'acquisizione light -sheet. Grazie alle linee laser a diodo opzionali e al laser bianco di ultima generazione integrato in STELLARIS, è possibile scegliere il colorante giusto per i propri esperimenti di light-sheet. Con STELLARIS 8, ora è possibile utilizzare dei coloranti nel range del vicino infrarosso.

    Sempre lo scanner giusto

    Sui sistemi STELLARIS dotati di un  tandem scanner, è possibile scegliere  tra il resonant scanner e il field of view scanner  (a 1400 Hz) per generare il light-sheet. La generazione del light-sheet con il resonant scanner permette di lavorare con pixel dwell time più brevi, permettendo di effettuare in imaging ancora più delicato.

    Progettazione software orientata al flusso di lavoro

    Il software LAS X guida gli utenti passo dopo passo nell'acquisizione e nella valutazione dei dati. Il design orientato al flusso di lavoro consente di utilizzare lo strumento in modo più efficiente. Una comoda procedura di calibrazione consente di definire con precisione il light-sheet.

    L'illuminazione del campione da due lati è garantita dal design: ciascuno dei due specchi TwinFlect può essere utilizzato dallo scanner in modo da evitare le aree più scure. Per immagini nitide con un ampio campo di osservazione, è possibile unire le due diverse immagini, generate ognuna utilizzando uno specchio, con l'opzione di fusione online o offline del Wizard LightSheet del software LAS X.

    Personalizza LAS X in base alle tue esigenze con pacchetti software aggiuntivi. Il modulo di visualizzazione LAS X 3D offre nuovi modi per interagire con i dati 3D grazie alla funzionalità intuitiva di clipping, rendering rapido e visualizzazione stereo. Gli esperimenti di mosaico ti consentono di osservare ampie aree. La funzione di Mark & Find consente di osservare diverse regioni di interesse e settare esperimenti di multi-posizione.

    Ottica superiore

    Obiettivi superiori per un'ampia gamma di applicazioni : una delle caratteristiche distintive di Leica Microsystems. Il cuore del nostro  sistema che ruota il light-sheet in verticale è formato dagli  obiettivi e dagli specchi TwinFlect.

    Con la scelta di obiettivi di illuminazione differenti, è possibile modellare il foglio di luce a seconda delle esigenze sperimentali.

    Per  rivelare i dettagli fini, avere un campo di osservazione più ampio   o adattarsi all'indice di rifrazione del mezzo in cui è immerso il campione, è possibile scegliere l'obiettivo di rilevazione ottimale tra un numero crescente di opzioni.

    Obiettivo Imaging su live cell Reagenti per lo schiarimento a base di zucchero Compatibili con lo schiarimento BAAB
    FLUOTAR L 25x/0.95 W  Sì No No
    APO L 20x/0,5 W Sì No No
    Fluotar L 16x/0,6 IMM Sì Sì Sì
    APO L 10x/0,3 Sì Sì No
    5x/0,15 IMM Sì Sì Sì

    Comoda gestione dei dati

    Osservando i processi in 3D e per lunghi periodi di tempo si generano molti dati. Diversi strumenti implementati nel software LAS X vi aiutano a gestire i vostri dati in modo pratico. Lo strumento di fusione online consente di scegliere se conservare i dati grezzi o  guadagnare spazio su disco salvando solo l'immagine fusa. I dati vengono memorizzati automaticamente durante l'acquisizione. Il caricamento intelligente facilita la revisione dei dati dandovi accesso diretto ai punti temporali o agli Z stack di interesse in grandi serie di dati di time-lapse. È possibile compilare i passaggi di post-elaborazione desiderati generando una pipeline che può essere eseguita automaticamente.

    Ottime condizioni ambientali

    Una camera climatica controllata da software mantiene le condizioni ambientali migliori per i tuoi campioni. Gli utenti ottengono il pieno controllo delle condizioni sperimentali con il modulo LAS X Environmental Control. I dati ambientali registrati possono essere monitorati durante l'esperimento. Tutte le condizioni ambientali possono essere impostate all'interno di un'unica interfaccia, quindi è possibile, ad esempio, eseguire profili di temperatura per esperimenti di shock termico.

    Scegli tra un incubatore a camera o soluzioni di incubazione top stage.

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