Virologia

Communications, Corporate

agosto 05, 2020

Virologia

Le soluzioni Leica per l'imaging e la preparazione dei campioni consentono di analizzare l'ingresso e la fusione virale, l'integrazione del genoma, la replicazione virale, l'assemblaggio e l'espansione dei virus.

Lo studio dei tessuti e delle cellule infettati dai virus per comprendere i meccanismi di infezione e sviluppare trattamenti per la malattia ha implicazioni complesse per la salute umana. Le soluzioni Leica per l'imaging e la preparazione dei campioni consentono di analizzare l'ingresso e la fusione virale, l'integrazione del genoma, la replicazione virale, l'assemblaggio e l'espansione dei virus. I dati provenienti dall'analisi di campioni ben preparati sono importanti anche per lo studio dei relativi meccanismi cellulari e delle risposte immunitarie. L'obiettivo finale è quello di sviluppare strategie di intervento.

I virus vengono esaminati a partire da biopsie fino ad arrivare a livello di singolo virione. Alcuni dei più comuni virus studiati sono l'influenza, i coronavirus (SARS-COV-2 che causa il COVID-19, ecc.), l'herpes, l'epatite, la dengue, lo Zika, l'HIV, la rabbia e l'Ebola, ma ne esistono molti altri.

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Leica Microsystems

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La ricerca Life Sciences

L’ospite del processo di infezione da virus

Nella ricerca di virus si utilizzano talvolta organismi modello, nonostante non riproducano esattamente la morfologia dell'ospite umano. Per questo motivo, i ricercatori si affidano più spesso a studi su tessuti umani, biopsie o colture cellulari.

I modelli di infezione ex vivo possono essere generati da tessuti, biopsie o modelli animali. Questi modelli possono essere esaminati con l'aiuto degli stereomicroscopi Leica.

Grazie ai microscopi Widefield Leica (compound), è possibile monitorare le colture cellulari, gli sferoidi e gli organoidi.

I microscopi a fluorescenza Leica più sofisticati, come i THUNDER imager, consentono di eseguire ulteriori indagini iniziali su modelli di infezione, colture cellulari in 2D o in 3D.

Un'analisi genetica a valle più affidabile può essere eseguita utilizzando la microdissezione laser di Leica Microsystems che isola cellule specifiche dal tessuto circostante.

In questa nota applicativa (Microscopy in Virology) vengono riportati esempi di applicazioni di virologia studiate con soluzioni Leica.

Ciclo di replicazione di un virus in una cellula ospite. Inizia con il legame del recettore sulla superficie cellulare. In seguito all'assorbimento, il contenuto virale viene rilasciato nella cellula. L'RNA (virus a RNA) può essere tradotto direttamente in proteine, mentre il DNA (virus a DNA) deve essere prima trascritto. Il genoma virale viene inoltre replicato nel nucleo o nelle cosiddette fabbriche di virus. A questo punto, i componenti virali vengono assemblati per costruire virioni intatti. Questi, infine, lasciano la cellula mediante esocitosi, gemmando attraverso la membrana plasmatica, o tramite lisi.

Microscopy in Virology

How to Sanitize a Microscope

Fluorescenza

Imaging a fluorescenza ad alta risoluzione per la ricerca sui virus

La microscopia ad alta risoluzione rappresenta una risorsa per gli studi sulle malattie infettive, poiché consente di tracciare i virus e i patogeni causativi. Se usata in combinazione con la marcatura fluorescente di componenti cellulari o virali, consente di sondare molteplici aspetti dei processi di infezione.

Pertanto, sia la microscopia confocale a scansione laser che quella a riflessione totale interna (TIRF), che consentono di ottenere la super-risoluzione, sono strumenti di elezione per la ricerca virale.

Le tecniche avanzate di microscopia, quali il multifotone e la microscopia light sheet, possono consentire l'accesso agli eventi di infezione che si verificano in contesti diversi, quali le sezioni di tessuto, i modelli animali e i modelli di infezione in 3D come gli organoidi.

I microscopi Leica, utili per lo studio di campioni in 3D riguardanti la ricerca sui virus includono la piattaforma confocale STELLARIS e le soluzioni TIRF.

Immagine e diagramma adattati da Coomer et al. PLOS Pathogen (2020) 16(2): e1008359, DOI: 10.1371/journal.ppat.1008359

Image illustrating doubled-labelled HIV pseudovirus particles decorated with JRFL Env (HIV-1JRFL) losing DiD signal (red) and maintaining immobile eGFP signal (green) when attempting fusion in 2-deoxyglucose (2-DG) treated TZM-bl cells, suggesting arrest at hemifusion. Diagram illustrating the concept of single-particle tracking with double-labelled virions with DiD and eGFP-gag. Image recorded with a SP8 X SMD confocal microscope. — Immagine che illustra particelle di pseudovirus HIV con doppia marcatura, decorate con JRFL Env (HIV-1JRFL) che perdono il segnale DiD (rosso) e mantengono immobile il segnale eGFP (verde) quando si tenta la fusione in cellule TZM-bl trattate con 2-deossiglucosio (2-DG), suggerendo l'arresto in emifusione. Diagramma che illustra il concetto di tracking delle singole particelle con virioni a doppia marcatura con DiD e eGFP-gag. Immagine generata con un microscopio confocale SP8 X SMD. Immagine e diagramma adattati da Coomer et al. PLOS Pathogen (2020) 16(2): E1008359, DOI: 10.1371/journal.ppat.1008359.

Introduction to Fluorescent Proteins

Molecular structure of the green fluorescent protein (GFP)

How to Prepare your Specimen for Immunofluorescence Microscopy

Cellular microtubule network in a fibroblast cell.

Studying Virus Replication with Fluorescence Microscopy

Image of immunofluorescently labelled cells where mitochondria are indicated with red, nuclei with blue, and actin with green.

How Can Immunofluorescence Aid Virology Research?

Influenca in lung epithelial cells (porcine) - THUNDER Imager 3D Cell Culture Influenca virus – red, cilia – green, Nuclei – blue.

Ultrastruttura dei virus

Per poter valutare l’ultrastruttura dei virus, è necessaria una risoluzione prossima a 1 nm. Al momento, questa risoluzione può essere ottenuta solo con la microscopia elettronica. Il Cryo EM consente di ottenere anche una risoluzione sub-nanometrica.

La risoluzione ultrastrutturale consente di osservare in nanoscala l'interazione tra ospite e virus, nonché di confermare i risultati ottenuti da diverse tecnologie analitiche e di identificare i potenziali siti di azione per farmaci. Inoltre, per la progettazione di vaccini e inibitori di ingresso virale risultano fondamentali i ligandi o le piccole molecole di recettori di superficie cellulare che sono target durante le interazioni di particelle virali.

Per i sistemi convenzionali e il Cryo EM, la preparazione dei campioni è fondamentale. Richiede attrezzature e competenze specifiche che Leica Microsystems è in grado di offrire disponendo di un ampio portafoglio per la preparazione di campioni EM oltre alla consulenza dei propri esperti.