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Sistema HC Leica Microsystems
Il sistema HC (Harmonic Compound System, sistema composto armonico) Leica Microsystems comprende componenti otticiassociati tra di loro per generare un'immagine ottimale e coinvolti nella correzione delle aberrazioni ottiche: obiettivi, oculari, tubi ottici, adattatore per fotocamera e TV.
Per la correzione di determinate aberrazioni ottiche, il microscopio è considerato il sistema di riferimento. Aberrazioni sferiche, coma e aberrazioni cromatiche assiali sono corrette al meglio nel punto in cui si originano, ad es. nel componente specifico. Aberrazioni cromatiche laterali e astigmatismo sono corretti in parallelo nell'obiettivo, nei tubi ottici e nell'oculare.
Il risultato dell'immagine ottimale si ottiene pertanto tramite l'interazione delle correzioni.
HC = L'obiettivo è incluso nel sistema HC.
HCX = L'obiettivo è compatibile anche con le ottiche prodotte precedentemente (ottiche Delta 1991-1997)
Il sistema HC garantisce:
- dimensioni ottiche e di aggiustaggio meccanico bilanciate,
- allineamento bilanciato di tutti i componenti del sistema ottico,
- soluzioni tecniche affidabili bilanciate,
- superlative prestazioni ottiche con tecnologia di produzione progressiva.
Ingrandimento dell'obiettivo
Su ogni obiettivo è contrassegnato il relativo ingrandimento, ad esempio 5x o 100x. Tuttavia, il solo valore dell'ingrandimento di un obiettivo non è indicativo della capacità di ingrandimento dell'intero microscopio. Quest'ultimo deriva dal prodotto tra fattore d'ingrandimento dell'obiettivo e fattore di ingrandimento dell'oculare (con tubo ottico 1x).
Esempio:
obiettivo 40x x oculare 10x = ingrandimento complessivo 400x.
Tuttavia, occorrerebbe tener conto che più è elevato il potere di ingrandimento di un obiettivo, più basso è il campo visibile dell'oggetto.
Numerical Aperture
The numerical aperture (NA or A) of the objective is a key parameter for the optical image and determines the resolving power of the objective and the brightness of the image. It is defined by the sine of the half aperture angle a of the lens and the refractive index n of the immersion medium. According to this definition, the larger the numerical aperture, the more narrow the focal spot and hence the higher the resolving power.
The objectives are labeled with their magnification, followed by the particular NA value, for instance 10x/0.40 or 63x/1.40. The numerical aperture of the objective can be changed by using iris diaphragm objectives.
The term 'numerical aperture’ is explained in detail in the Leica Science Lab article: "Beware of "Empty" Magnification"
Iris Diaphragm
By using iris diaphragm objectives the numerical aperture of the objective can be changed. This is especially useful for widefield microscopy. If the iris diaphragm is closed, the numerical aperture and resolution are reduced but the depth of field is increased. If the iris diaphragm is opened again, the numerical aperture is increased, the resolution is increased, but the depth of field is decreased. An objective can also be used as a darkfield objective by narrowing the aperture.
Iris diaphragm objectives are labeled with the range within which the numerical aperture can be adjusted, for instance 1.4 – 0.7.
The physical relationship between aperture, resolving power and depth of field is shown in the graph. A small aperture produces low resolution but large depth of field. A high aperture means better resolution but less depth of field.
Linear correlation between aperture and resolution (green), respectively exponential correlation between aperture and depth of field (red)
Correction Collar
The performance of high-resolution objectives is optimal when the refractive indices of the specimen and all intermediate optical media match the values for which the objective is designed. Changes in coverglass thickness and temperature as well as inhomogeneous, thick specimens introduce refractive index mismatches. This causes deterioration of the point-spread function, geometric distortion, and chromatic aberration. These effects limit penetration depth, contrast, and intensity of the microscope images.
Immersion oil traditionally has a refractive index close to standard crown glass. Oil immersion objectives are designed for the refractive index of this oil. They are optimal when working close to the coverglass or with samples embedded in a medium with a refractive index close to that of immersion oil. For samples with refractive indices deviating from this value special objectives are offered. Most common are water immersion objectives, and glycerol immersion objectives. Water and glycerol immersion objectives are very sensitive to changes in coverglass – introducing a changing thickness of a medium with refractive index mismatch – temperature, and deviations of the immersion medium or the sample itself. Therefore, water and glycerol immersion objectives with a higher NA have a correction collar to compensate for those differences.
The correction collar axially moves the central lens group and can be used to restore optimal image resolution and brightness. As manual adjustment of the correction collar requires time and experience and can disturb the sample, Leica offers water immersion objectives with a motorized correction collar.
CORR = Objective with correction collar
Distanza di lavoro extra lunga
L'area del campione accessibile spesso viene limitata da collisioni dell'obiettivo con il portacampioni, dai bordi di una piastra multipozzetto o da altre apparecchiature, ad es. per l'elettrofisiologia o l'Imaging intravitale. Gli obiettivi con distanza di lavoro extra lunga permettono di analizzare anche i bordi di tali campioni, senza limitazioni.
Anche l'Imaging dei tessuti profondi tramite eccitazione multifotone o in tessuti liberati richiede obiettivi con elevata distanza di lavoro libera, per sfruttare appieno i vantaggi ottici di queste tecniche. In questo campo, l'esigenza di distanze di lavoro superiori a un millimetro non è fuori dal comune. Tuttavia, l'apertura numerica dell'obiettivo deve continuare a essere più grande possibile per fornire immagini ad alta risoluzione significative.
Leica Microsystems offre una serie di obiettivi a grande distanza di lavoro libera per applicazioni a secco o per immersione in acqua. Gli obiettivi per immersione in acqua con distanze di lavoro extra lunghe sono disponibili anche con un angolo di accesso significativo e una parte frontale ceramica inerte dotata di conduttività elettrica e termica minima per l'elettrofisiologia.
L = obiettivo con distanza di lavoro libera extra lunga
Obiettivi per immersione in acqua con distanze di lavoro libere extra lunghe
HCX APO L 20x/1,0 W con filettatura M32 per l'uso su Leica DM6000 FS e CFS, FWD: 2 mm
HCX IRAPO L 25x/0,95 W con filettatura M25 per l'uso su qualsiasi microscopio, FWD: 2,5 mm
HCX APO serie L U-V-I, FWD: 2,2 - 3,6 mm
Piano focale posteriore
Gli obiettivi Leica Microsystems sono definiti da piani focali posteriori fissi (vedere l'illustrazione).
Il codice del piano focale posteriore dell'obiettivo serve come riferimento per la selezione del corrispondente prisma DIC lato obiettivo, se necessario. In questo modo si ha il vantaggio che diversi obiettivi possono essere utilizzati con un prisma DIC.
A, B, C, D o E = piano focale posteriore dell'obiettivo
Abbinamento del vetrino coprioggetto
Il vetrino coprioggetto è un importante componente del percorso ottico e deve pertanto soddisfare gli stessi standard di qualità ottica dell'obiettivo. Gli obiettivi ad alta qualità riescono a raggiungere il massimo potenziale solo se sono utilizzati mezzo di immersione e vetrino coprioggetto corretti.
Gli obiettivi a secco, per acqua e per glicerina sono estremamente sensibili alle variazioni di spessore del vetrino coprioggetto. Per correggere tali deviazioni, è possibile utilizzare obiettivi con anello di correzione.
Coprioggetto e liquidi di immersione:
| Mezzo di immersione | Con o senza coprioggetto | Tipo di coprioggetto 1.5 | Tipo di coprioggetto 1.5 H |
|---|---|---|---|
| Aria | NA < 0,30 | NA < 0,70 | NA > 0,70 |
| Acqua | NA < 0,60 | NA < 0,90 | NA > 0,90 |
| Tipo di immersione G (glicerina) | NA < 0,80 | NA < 1,10 | NA > 1,10 |
| Tipo di immersione N (olio) | NA < 0,90 | NA < 1,30 | – |
| Tipo di immersione F (olio) | NA < 0,90 | NA < 1,30 | NA > 1,30 |
Tabella 1: Coprioggetto e liquidi di immersione
BD | per campo chiaro/campo scuro a luce incidente |
|---|---|
PH | obiettivo per contrasto di fase |
RC | obiettivo per contrasto di riflessione (solo con DM R) |
P, POL | bassa deformazione, per la polarizzazione quantitativa |
/ | non per luce incidente, tranne la fluorescenza |
LMC | obiettivo per contrasto a modulazione (solo con Leica DM IRB) |
Mezzi di immersione per gli obiettivi
Per un'elevata potenza di risoluzione, l'apertura numerica (NA) di un obiettivo deve essere superiore a 1. Ciò richiede che anche il mezzo di immersione abbia un indice di rifrazione superiore a 1, ovvero diverso dall'aria. I mezzi di immersione comuni sono olio, acqua e glicerina. Il mezzo di immersione da utilizzare con un determinato obiettivo è indicato sull'obiettivo.
Indici di rifrazione
Tutti gli elementi rilevanti a livello ottico (mezzo di immersione, coprioggetto, campione) davanti alla lente anteriore dell'obiettivo hanno un'influenza significativa sulla qualità dell'immagine. Idealmente, l'indice di rifrazione in tutti questi strati ottici deve corrispondere agli indici di rifrazione per cui è stato progettato l'obiettivo. In realtà, questo risulta difficilmente possibile, in quanto i campioni spesso sono disomogenei, lo spessore del coprioggetto non è così preciso e la temperatura cambia durante l'acquisizione dell'immagine.
Questi fattori devono essere considerati quando si sceglie un obiettivo e il mezzo di immersione per una determinata applicazione.
Maggiore è l'apertura numerica dell'obiettivo e più profonde sono le strutture di interesse all'interno del campione, più risulta importante rispettare gli indici di rifrazione del campione e del mezzo di immersione. Indici di rifrazione diversi comportano aberrazioni sferiche e distorsioni geometriche delle strutture. Questo comporta una perdita di contrasto e definizione, oltre a un aspetto delle strutture compresso o allungato.
Indici di rifrazione di alcuni importanti mezzi di immersione:
| Celle in coltura | 1.33 - 1.38 |
|---|---|
| Olio tipo F | 1.52 |
| Glicerina | 1,45 (21 °C) - 1,46 (37 °C) per il liquido di immersione Leica tipo G |
| Olio di silicone | 1.41 |
| Acqua | 1.33 |
100% PBS pH 8,9 | 1.34 |
Mowiol | 1.46 |
| Balsamo del Canada | 1.52 |
| CLARITY | 1.45 |
| BABB | 1.54 |
| Vetrini coprioggetto | 1.52 |
Olio
L'indice di rifrazione dell'olio di immersione Leica tipo N e tipo F è 1,518 (a 23 °C e 546 nm), ovvero lo stesso del vetro Crown standard (n=1,518). Per l'Imaging multicolore, anche la dispersione dell'olio di immersione è importante. Spesso viene detta anche numero di Abbe e deve corrispondere al numero di Abbe per il quale è stato progettato l'obiettivo, altrimenti si verificano aberrazioni cromatiche. Ad esempio, l'olio di immersione di tipo N Leica presenta un numero di Abbe di 42,1, mentre l'olio di immersione tipo F presenta un numero di Abbe di 46, valore ottimale per l'Imaging in fluorescenza. Il tipo N non è adatto all'Imaging in fluorescenza.
Gli obiettivi per immersione in olio sono l'ideale per campioni che si trovano in un mezzo corrispondente all'indice di rifrazione dell'olio, ovvero campioni fissati in modo classico inclusi in resina, balsamo del Canada o glicerina-gelatina o che sono elaborati in Imaging vicino al coprioggetto, ovvero a meno di pochi µm. Più lontano dal coprioggetto, luminosità e risoluzione dell'immagine peggiorano rapidamente se gli indici di rifrazione non corrispondono.
Per l'Imaging su cellule vive, ovvero l'Imaging in un campione acquoso, consigliamo vivamente l'uso di immersione in acqua o glicerina.
Gli obiettivi per immersione in olio con aperture estremamente elevate raggiungono le massime prestazioni ottiche solo in un intervallo di temperature relativamente ristretto, in quanto l'indice di rifrazione dell'olio di immersione dipende significativamente dalla temperatura. Più grande è la distanza di lavoro libera, più spesso è lo strato di olio e pertanto maggiore risulta l'impatto delle aberrazioni relative alla temperatura sulla qualità dell'immagine. Questo effetto della temperatura varia linearmente con la distanza di lavoro libera, ma dipende dall'apertura numerica alla quarta.
Per esperimenti a temperature che deviano dalla temperatura ambiente, si consiglia l'immersione in acqua, in quanto l'indice di rifrazione dell'acqua è significativamente meno dipendente dalla temperatura e può essere compensato, visto anche che molti obiettivi per immersione in acqua sono dotati di anello di correzione.
Acqua
Gli obiettivi per immersione in acqua sono ottimali per osservare le cellule vive in mezzi acquosi, in quanto gli indici di rifrazione del mezzo di immersione e del campione corrispondono maggiormente rispetto ad esempio all'olio di immersione. Tuttavia, a 37 °C l'acqua evapora rapidamente. Il microdispenser per immersione in acqua Leica aggiunge automaticamente acqua durante l'esecuzione di un esperimento per mantenere un'immersione stabile in acqua.
Glycerol
Oggi, i campioni maggiormente fissi come cellule in coltura, sezioni tissutali di campioni spessi, oltre a embrioni interi sono montati in Mowiol, Vectashield o miscele simili contenenti acqua e glicerina più diverse sostanze chimiche, come ad esempio sostanze anti-sbiadimento e di preservazione. Questi mezzi possiedono indici di rifrazione vicini a quelli di una miscela 80% glicerina / 20% acqua (n=1,45). Gli obiettivi per immersione in glicerina sono eccellenti per campioni montati in qualsiasi mezzo con un indice di rifrazione che si avvicina a 1,45 - 1,46.
Gli obiettivi per immersione in glicerina offrono un anello di correzione per regolare le ottiche su indici di rifrazione variabili derivanti dalle variazioni di composizione del mezzo di montaggio o dalle variazioni di spessore del coprioggetto o di temperatura. La lettera applicativa n. 17 (aprile 2004) fornisce una descrizione molto dettagliata degli obiettivi per immersione in glicerina e degli effetti di indici di rifrazione non corrispondenti.
La maggior parte degli obiettivi multi-immersione (IMM) è utilizzabile per l'immersione in glicerina, oltre che in acqua e olio, come descritto di seguito.
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