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Segui le interazioni molecolari con la tecnica FLIM-FRET

La ricerca moderna analizza il modo in cui le molecole interagiscono per svolgere compiti vitali. La tecnica FLIM-FRET rappresenta lo standard di riferimento per esplorare queste interazioni.

STELLARIS 8 FALCON definisce un nuovo standard di velocità per gli strumenti FLIM.

Rende possibile utilizzare FRET in eventi cellulari altamente dinamici. È possibile acquisire e interpretare i dati FRET negli esperimenti quotidiani.

Caged cAMP in cellule HeLa esprimenti il sensore FRET EPAC mT2-dVenus. Risposta di EPAC all'uncaging del cAMP indotto dagli UV (area centrale). Filmato acquisito a 4 fps. Dimensione dell'immagine: 256 x 256 pixel. Barra colorata (lifetime): ns. Gentile concessione di Kees Jalink, Bram van den Broek, NKI Amsterdam.

Oscillazioni di calcio dopo la stimolazione con peptide attivatore della trombina. Nelle singole cellule, la risposta viene registrata come cambiamento di lifetime. Filmato acquisito a 4 fps. Dimensione dell'immagine: 256 x 256 pixel. Barra colorata (lifetime): ns. Gentile concessione di Kees Jalink, Bram van den Broek, NKI Amsterdam.

Segui i piccoli e rapidi cambiamenti utilizzando i biosensori

I biosensori sono potenti rilevatori dell’attività metabolica, dei meccanismi di signaling, delle modifiche al pH e microambiente.

STELLARIS 8 FALCON assicura l'accesso alle informazioni contenute nei tempi di vita della fluorescenza, anche per eventi ultraveloci, come la dinamica del potenziale di membrana. Queste informazioni integrano l'imaging spettrale ad intensità di fluorescenza e le modalità TauSense fornite da STELLARIS 8.

Imaging metabolico più affidabile e sensibile

L'autofluorescenza può rappresentare un  problema nell'imaging convenzionale.FALCON  STELLARIS 8 la trasforma in informazioni preziose. Oggi è possibile trasformare l'autofluorescenza in un rilevatore dello stato metabolico, della differenziazione cellulare e dello sviluppo tumorale.

STELLARIS 8 FALCON consente inoltre di osservare il contrasto nel tessuto vivo, dove la marcatura della fluorescenza risulta spesso aspecifica o distrugge le condizioni fisiologiche. 

Autofluorescenza in cellule di mammifero in condizioni non fisiologiche (pH 8,5). Il segnale è correlato alle variazioni del pool endogeno NAD/NADH. Lo sviluppo dello stress ossidativo si deve interpretare come diminuzione dei tempi di vita della fluorescenza nel tempo. Dimensioni dell’immagine originale: 512 x 512 pixel. Barra colorata (lifetime): ns.
Intensità
FLIM

Separazione dei fluorofori al di là delle possibilità spettrali

La marcatura a fluorescenza rappresenta il metodo standard per differenziare le strutture intracellulari. La separazione spettrale è molto potente, ma talvolta limitata quando gli spettri di emissione sono troppo vicini.

Con STELLARIS 8 FALCON è possibile sfruttare tutto il potenziale dell'imaging basato sul lifetime della fluorescenza per separare più sonde fluorescenti utilizzando il fitting esponenziale, il pattern fitting e la nuova analisi di separazione tramite fasori FLIM.

Immagine interattiva: Strutture del citoscheletro distinte mediante i diversi tempi di vita. Vimentina immunomarcata con Alexa Fluor 555 (verde), e tubulina immunomarcata con Alexa Fluor 546 (blu). I fluorofori sono molto simili spettralmente, ma sono separati utilizzando le informazioni sui tempi di vita della fluorescenza. Dimensione dell'immagine: 512 x 512 pixel.

STELLARIS 8 FALCON per un rapido lifetime imaging

Il microscopio STELLARIS 8 FALCON supera le limitazioni legate alla velocità FLIM e apre le porte all'utilizzo di dati di lifetime veloci.

Finora, le informazioni funzionali estratte dai lifetime di fluorescenza di processi veloci erano difficili da ottenere a causa dei vincoli tecnici della tecnica FLIM. La velocità di acquisizione FLIM era almeno 10 volte più lenta rispetto alla registrazione del segnale di intensità confocale.

L'imaging rapido di STELLARIS 8 FALCON basato sul contrasto di lifetime permette di seguire i processi dinamici nelle cellule con un ritmo appropriato. Queste attività sono possibili grazie a un nuovo modo di misurare il tempo utilizzando il TCSPC (Time-Correlated Single Photon Counting) insieme ad algoritmi intelligenti per la gestione e l'analisi dei dati.

Application note su Nature: SP8 FALCON: un nuovo concetto di imaging basato sul tempo di vita di fluorescenza che consente di eseguire FLIM confocale in video rate

Immagine a singolo canale di beads fluorescenti (magenta) in una soluzione contenente Alexa Fluor 555 (verde). E' possibile effettuare la separazione dei fluorofori basata sui tempi di vita della fluorescenza a varie velocità, ad esempio 16 fps (in alto), 27 fps (video-rate, al centro) e 83 fps (ultra-veloce, in basso). L'utilizzo delle informazioni sui tempi di vita per la separazione dei fluorocromi è molto più vantaggioso rispetto al segnale in intensità (scala di grigi). I filmati mostrano il fitting pixel per pixel del tempo di vita dei componenti. Dimensioni del frame: 512 x 64 pixel. Scale bar: 10 µm.
Acquisizione semplice di campioni complessi. Mosaico ad alta risoluzione di embrione di topo formato da 722 tessere contenenti 190 Megapixel. Dati FLIM fittati con quattro valori di lifetime di fluorescenza caratteristici, in codice colore. Acquisizione: 1:23 h. Analisi: 1:00 h

Imaging multimodale all-in-one

Con STELLARIS 8 FALCON combinare FLIM con altre modalità non è mai stato così semplice. Fino ad ora i ricercatori hanno dovuto effettuare complessi cablaggi e pesanti trasferimenti di file. Grazie al STELLARIS 8 FALCON, è possibile integrare le informazioni dei tempi di vita nel normale flusso di lavoro confocale.

STELLARIS 8 FALCON è totalmente integrato nel software di acquisizione e analisi LAS X. È in grado di registrare dati FLIM in quattro canali spettrali in simultanea e fino a 10 canali in sequenza. STELLARIS 8 FALCON consente di accedere al contrasto basato sui tempi di vita in stack 3D, sequenze time-lapse e persino in mosaici di grande formato.

LAS X NAVIGATOR consente di espandere l’area di visualizzazione fino a 10.000 volte, risparmiando tempo prezioso nell'identificazione delle regioni di interesse e nell'esplorazione dei campioni in un modo completamente nuovo. 

Definizione diretta dei tempi di vita mediante fasori

L’analisi effettuata con STELLARIS 8 FALCON mediante fasori FLIM  fornisce una visualizzazione 2D delle componenti di lifetime. Con i fasori FLIM è possibile seguire i cambiamenti microambientali, separare le componenti all'interno di un multiplex e determinare l'efficienza FRET.

Le cellule sono marcate con Alexa555-Phalloidin e H2B mCherry. La separazione viene eseguita mediante i fasori FLIM. Il grafico del fasore mostra chiaramente due contributi. Per gentile concessione di: Dott. Martin Stöckl, Dipartimento di Biologia, Università di Costanza, Germania. 
Filosofia 1-clic per concentrarsi sugli aspetti scientifici: STELLARIS 8 FALCON controllato dal software LAS X.

I risultati di cui hai bisogno - con un solo clic

Il software LAS X consente di abilitare la modalità FLIM con un solo clic e di utilizzare la stessa filosofia dell’imaging spettrale di routine.

Anche chi utilizza la microscopia come tecnica complementare, potrà trovare gli elementi basilari e acquisire immagini immediatamente.

Appositi workflow consentono di utilizzare funzioni più specifiche anche in automazione.

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