Étiquetage des objectifs

Les objectifs Leica sont codés et étiquetés différemment en fonction de leur type.

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Système HC de Leica Microsystems

Le système HC Leica Microsystems (système de composants harmoniques) comprend les composants optiques qui ont été assortis entre eux pour une génération d'image optimale et qui sont impliqués dans la correction des aberrations optiques : objectifs, œilletons, lentilles de tubes, adaptateur de caméra et TV.

Pour la correction de certaines aberrations optiques, le microscope est considéré comme un système complet. Les aberrations sphériques, les aberrations de coma et chromatiques axiales sont mieux corrigées au niveau de leur emplacement d'origine, par ex. dans le composant particulier. Les aberrations chromatiques latérales et l'astigmatisme sont corrigés en parallèle dans l'objectif, la lentille de tube et l'œilleton.

Le résultat d'image optimal est donc atteint au moyen de l'association des corrections.

HC = L'objectif est intégré dans le système HC.

HCX = L'objectif est également compatible avec des optiques plus anciennes (Delta optics 1991-1997)

Le système HC garantit

  • des dimensions de montage optiques et mécaniques équilibrées,
  • un alignement équilibré de tous les composants du système optique,
  • des solutions techniques équilibrées et fiables,
  • des performances optiques exceptionnelles avec une technologie de fabrication progressive.

Grossissement de l'objectif

Chaque objectif est étiqueté selon son grossissement, par exemple 5x ou 100x.  Toutefois, le grossissement de l'objectif à lui seul ne détermine pas le grossissement global du microscope. Ce dernier est le produit du grossissement de l'objectif multiplié par le grossissement de l'oculaire (pour une lentille de tube de 1x).  

Exemple:

Objectif de 40x x oculaires de 10x = grossissement global de 400x.

Il faut noter toutefois que plus le grossissement de l'objectif est élevé, moins le champ de l'objet est visible.

Numerical Aperture

The numerical aperture (NA or A) of the objective is a key parameter for the optical image and determines the resolving power of the objective and the brightness of the image. It is defined by the sine of the half aperture angle a of the lens and the refractive index n of the immersion medium. According to this definition, the larger the numerical aperture, the more narrow the focal spot and hence the higher the resolving power.

The objectives are labeled with their magnification, followed by the particular NA value, for instance 10x/0.40 or 63x/1.40. The numerical aperture of the objective can be changed by using iris diaphragm objectives.

The term 'numerical aperture’ is explained in detail in the Leica Science Lab article: "Beware of "Empty" Magnification"

Iris Diaphragm

By using iris diaphragm objectives the numerical aperture of the objective can be changed. This is especially useful for widefield microscopy. If the iris diaphragm is closed, the numerical aperture and resolution are reduced but the depth of field is increased. If the iris diaphragm is opened again, the numerical aperture is increased, the resolution is increased, but the depth of field is decreased. An objective can also be used as a darkfield objective by narrowing the aperture.

Iris diaphragm objectives are labeled with the range within which the numerical aperture can be adjusted, for instance 1.4 – 0.7. 

The physical relationship between aperture, resolving power and depth of field is shown in the graph. A small aperture produces low resolution but large depth of field. A high aperture means better resolution but less depth of field. 

Linear correlation between aperture and resolution (green), respectively exponential correlation between aperture and depth of field (red)

Correction Collar

The performance of high-resolution objectives is optimal when the refractive indices of the specimen and all intermediate optical media match the values for which the objective is designed. Changes in coverglass thickness and temperature as well as inhomogeneous, thick specimens introduce refractive index mismatches. This causes deterioration of the point-spread function, geometric distortion, and chromatic aberration. These effects limit penetration depth, contrast, and intensity of the microscope images.

Immersion oil traditionally has a refractive index close to standard crown glass. Oil immersion objectives are designed for the refractive index of this oil. They are optimal when working close to the coverglass or with samples embedded in a medium with a refractive index close to that of immersion oil. For samples with refractive indices deviating from this value special objectives are offered. Most common are water immersion objectives, and glycerol immersion objectives. Water and glycerol immersion objectives are very sensitive to changes in coverglass – introducing a changing thickness of a medium with refractive index mismatch – temperature, and deviations of the immersion medium or the sample itself. Therefore, water and glycerol immersion objectives with a higher NA have a correction collar to compensate for those differences.

The correction collar axially moves the central lens group and can be used to restore optimal image resolution and brightness. As manual adjustment of the correction collar requires time and experience and can disturb the sample, Leica offers water immersion objectives with a motorized correction collar.

CORR = Objective with correction collar

Très grande distance de travail

La zone d'échantillons accessibles est souvent restreinte par des collisions entre l'objectif et le porte-échantillon, les bords de la platine multipuits ou toute autre pièce d'équipement, par ex. dans le cadre de tâches d'imagerie en électrophysiologie ou intravitale. Les objectifs offrant une très grande distance de travail permettent de visualiser aussi les contours de ces échantillons sans restriction.

 

L'imagerie des tissus profonds par excitation multiphotons ou sur tissus éclaircis demande l'utilisation d'objectifs à grande distance de travail pour pouvoir profiter pleinement des avantages optiques qu'offrent de telles techniques. Ici, des distances de travail de plus d'un millimètre sont fréquemment requises. Cependant, l'ouverture numérique de l'objectif doit rester aussi large que possible pour générer des images haute résolution probantes.

Leica Microsystems offre un vaste choix d'objectifs à très grande distance de travail pour à sec ou pour l'immersion dans l'eau. Les objectifs à très grande distance de travail pour immersion dans l'eau sont également disponibles avec un grand-angle d'accès et une partie frontale inerte en céramique, avec une conductivité thermique et électrique minimum pour l'électrophysiologie.

L = Objectif à très grande distance de travail

Objectifs à immersion dans l'eau avec de très grandes distances de travail

HCX APO L 20x/1,0 W

HCX APO L 20x/1,0 W avec filetage M32 pour une utilisation avec les Leica DM6000 FS et CFS, FWD : 2 mm

HCX IRAPO L 25x/0,95 W

HCX IRAPO L 25x/0,95 W avec filetage M25 pour une compatibilité avec tous les microscopes, FWD : 2,5 mm

HCX APO L série U-V-I

HCX APO L série U-V-I, FWD : 2,2 – 3,6 mm

Plan focal arrière

Les objectifs Leica Microsystems sont définis par des plans focaux arrière fixes (voir l'illustration).

Le code du plan focal arrière de l'objectif sert de référence pour la sélection du prisme CIT compatible côté objectif si nécessaire. Cela présente l'avantage que plusieurs objectifs peuvent être utilisés avec un seul prisme CIT.

A, B, C, D ou E = Plan focal arrière de l'objectif

Couvre-objets assortis

Le couvre-objet est un composant important du faisceau optique et devrait par conséquent répondre aux mêmes normes de qualité optique que celles de l'objectif. Les objectifs de haute qualité ne peuvent livrer leur plein potentiel que si les milieux d'immersion et couvre-objet utilisés sont corrects.

Les objectifs à sec, à immersion dans l'eau et le glycérol sont extrêmement sensibles aux écarts d'épaisseur du couvre-objet. Les objectifs avec une bague de correction peuvent être utilisés pour corriger ces écarts.

pour utilisation avec et sans couvre-objet

0

pour utilisation sans couvre-objet

0.17

pour utilisation avec couvre-objet de 0,17 mm (DIN/ISO)

1.8Q

pour utilisation avec verre de quartz de 1,8 mm sur des platines chauffantes

0-2

pour utilisation avec des couvre-objets de 0 à 2 mm d'épaisseur

Les épaisseurs de couvre-objet standard disponibles sont :

Nº 1

0.13mm-0.17mm

Nº 1.5

0.16mm-0.19mm

Nº 1.5H

0.17mm +/-0.005mm

Le type de couvre-objet offrant les meilleurs résultats dépendra du milieu d'immersion et de l'ouverture numérique (NA). Le tableau 1 peut être utilisé comme guide.

Couvre-objets et liquides d'immersion :

Milieu d'immersionAvec ou sans couvre-objetCouvre-objet de type 1,5Couvre-objet de type 1,5 H
AirNA < 0,30NA < 0,70NA > 0,70
EauNA < 0,60NA < 0,90NA > 0,90
Type d'immersion G (Glycérol)NA < 0,80NA < 1,10NA > 1,10
Type d'immersion N (Huile)NA < 0,90NA < 1,30
Type d'immersion F (Huile)NA < 0,90NA < 1,30NA > 1,30

Tableau 1 : Couvre-objets et liquides d'immersion

Méthodes de contraste

Les méthodes de contraste visualisent les décalages de phase qui sont autrement invisibles à l'œil nu et permettent ainsi l'observation d'échantillons vivants non colorés.

Les objectifs particulièrement appropriés aux méthodes spécifiques de contraste sont étiquetés en conséquence.

BD

pour fond clair/fond noir d'épiscopie

PH

objectif de contraste de phase

RC

objectif de contraste de modulation (uniquement avec DM R)

P, POL

faible contrainte, pour polarisation quantitative

/

non utilisé pour épiscopie sauf en fluorescence

LMC

objectif de contraste de modulation (uniquement avec DM IRB Leica)

Milieux d'immersion pour objectifs

Pour une haute puissance de résolution, l'ouverture numérique (NA) d'un objectif doit être supérieure à 1. Il faut également un milieu d'immersion dont l'indice de réfraction est supérieur à 1, autre que l'air. Les milieux d'immersion les plus courants sont l'huile, l'eau et le glycérol. Le milieu d'immersion qui devrait être utilisé est indiqué sur l'objectif.

Multi-immersion

Les objectifs adaptés à plusieurs liquides d'immersion (par ex. l'huile, l'eau et le glycérol) peuvent être utilisés avec le milieu d'immersion optimal de nombreux échantillons.

Objectifs multi-immersion :

  • HC PL APO 10x/0,40 IMM CS
  • HC PL APO 20x/0,75 IMM CS2

HUILE

Huile d'immersion standard DIN/ISO

W

Eau

GLYC

Glycérol

IMM

Autre milieu d'immersion, ou plus d'un seul milieu

Indices de réfraction

Tous les éléments d'optique (milieu d'immersion, couvre-objet, échantillon) devant la lentille frontale de l'objectif ont une influence majeure sur la qualité de l'image. Idéalement, l'indice de réfraction sur toutes ces couches optiques doit correspondre aux indices de réfraction pour lesquels a été conçu l'objectif. Mais en réalité, ceci est difficile, car les échantillons sont souvent inhomogènes, l'épaisseur du couvre-objet n'est pas très précise et la température varie durant le processus d'acquisition d'image.

Ces facteurs doivent être gardés en mémoire lors de la sélection de l'objectif et du milieu d'immersion dans le cadre d'une certaine application.

Plus l'ouverture numérique de l'objectif est grande et plus les structures d'intérêt de l'échantillon sont profondes, plus il est important de faire correspondre les indices de réfraction de l'échantillon et du milieu d'immersion. Des indices de réfraction différents entraînent des aberrations sphériques et des distorsions géométriques des structures. Cela entraîne ensuite une perte de contraste et de définition ainsi que des structures apparaissant comprimées ou étirées.

Indices de réfraction de certains milieux d'immersion les plus importants:

Cellules de culture

1.33 - 1.38

Huile de type F

1.52

Glycérol1,45 (21 °C) - 1,46 (37 °C) pour un liquide d'immersion Leica de type G
Huile silicone

1.41

Eau

1.33

100% PBS pH 8,9

1.34

Mowiol

1.46

Baume du Canada

1.52

CLARITY

1.45

BABB

1.54

Couvre-objet

1.52

Huile

L'indice de réfraction de l'huile d'immersion Leica de type N et F est de 1,518 (à 23 °C et 546 nm), c'est-à-dire le même que celui du crown-glass standard (n=1,518). Pour l'imagerie multicolore, la dispersion de l'huile d'immersion est elle aussi importante. On l'appelle souvent le nombre d'Abbe, et il doit correspondre au nombre d'Abbe pour lequel l'objectif a été conçu, car des aberrations chromatiques pourraient autrement survenir. Par exemple, l'huile d'immersion Leica de type N a pour nombre d'Abbe 42,1 tandis que l'huile d'immersion de type F a un nombre d'Abbe de 46, optimal pour l'imagerie de fluorescence. Le type N n'est pas adapté à l'imagerie de fluorescence.

Les objectifs à immersion dans l'huile sont idéaux pour les échantillons immergés dans un milieu ayant le même indice de réfraction que l'huile, c'est-à-dire, de manière générale, les spécimens fixes figés dans de la résine, du baume du Canada ou du glycérol-gélatine, ou qui sont observés très proche du couvre-objet (à moins de quelques µm). Plus on s'éloigne du couvre-objet, plus la clarté et la résolution de l'image se détériorent si les indices de réfraction sont dépareillés.

Pour l'imagerie de cellules vivantes, autrement dit l'imagerie d'échantillons aqueux, nous recommandons fortement l'utilisation de l'immersion dans l'eau ou le glycérol.

Les objectifs à immersion dans l'huile avec des ouvertures très grandes procurent uniquement leurs performances optiques optimales dans un intervalle de température relativement restreint puisque l'indice de réfraction de l'huile d'immersion dépend essentiellement de la température : Plus la distance de travail est élevée, plus la couche d'huile sera épaisse et donc plus les aberrations liées à la température auront d'impact sur la qualité d'image. Cet effet de température change de façon linéaire avec la distance de travail, mais dépend de l'ouverture numérique.

Pour les expériences réalisées à des températures non ambiantes, l'immersion dans l'eau est recommandée, car l'indice de réfraction de l'eau dépend beaucoup moins de la température et peut être compensé, notamment parce que de nombreux objectifs à immersion dans l'eau sont dotés de bagues de correction.

Eau

Les objectifs à immersion d'eau sont optimaux pour l'observation de cellules vivantes dans des milieux aqueux, car les indices de réfraction du milieu d'immersion et de l'échantillon se correspondent mieux que dans le cas de l'huile d'immersion, par exemple. L'eau, en revanche, s'évapore rapidement à 37 °C. Le micro distributeur d'immersion aquatique Leica ajoute automatiquement de l'eau pendant le déroulement de l'expérience afin de garantir une immersion stable.

Glycérol

Aujourd'hui, la majorité des échantillons fixes tels que les cellules de culture, les coupes de tissu de spécimens épais et les embryons in toto sont placés dans des mélanges de Mowiol, Vectashield ou semblable contenant de l'eau, du glycérol et divers produits chimiques, par ex. des substances anti-décoloration ou de conservation. Ces milieux d'immersion ont des indices de réfraction proches du mélange glycérol/eau 80 %/20 % (n = 1,45). Les objectifs à immersion dans le glycérol sont excellents pour les échantillons placés dans un milieu ayant un indice de réfraction proche des 1,45 – 1,46.

Les objectifs Leica à immersion dans le glycérol sont dotés d'une bague de correction permettant d'ajuster l'optique à divers indices de réfraction résultant notamment de différentes compositions des milieux de placement, ou de variations dans l'épaisseur du couvre-objet ou de la température. La Lettre d'application N° 17 (avril 2004) offre une description très détaillée des objectifs à immersion dans le glycérol, et des effets d'une mauvaise correspondance entre les indices de réfraction.

La plupart des objectifs multi-immersion (IMM) peuvent être utilisés dans le glycérol, comme dans l'eau ou l'huile (voir ci-dessous).

Immersion dans le glycérol

Objectif à utiliser lors d'une immersion dans le glycérol :

  • HC PL APO 63x/1.30 GLYC CORR CS2
  • HC PL APO 40x/1.25 GLYC CORR CS2
  • HC PL APO 40x/1.25 GLYC motCORR CS2
  • HC PL APO 93x/1.30 GLYC motC STED W
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