Rivestimento
Si riveste un campione con uno strato conduttivo di carbonio o di metallo per inibire la carica, ridurre il danno termico e migliorare il segnale elettronico secondario per l'esame topografico nella SEM. Per l'analisi TEM dei campioni, vengono utilizzate griglie rivestite di carbonio o si riveste il campione stesso con uno strato sottile sulla parte superiore. La linea di spalmatrici Leica Microsystems include la spalmatrice a vuoto spinto Leica EM ACE600 per l'analisi della massima risoluzione in FE-SEM e TEM e la polverizzatrice Leica EM ACE200 e/o la spalmatrice in filo di carbonio che rappresentano un sistema completamente automatizzato per la manipolazione rapida, pratica e intuitiva.
Perché è necessario rivestire i campioni quando si esegue la microscopia elettronica (EM)?
Per l'imaging EM, un campione che non è intrinsecamente conduttivo deve essere rivestito con uno strato conduttivo per inibire i rischi di carica e prevenire danni termici al campione. In alcuni casi, per migliorare il segnale secondario di emissione di elettroni si utilizzano le pellicole metalliche.
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La tecnica di rivestimento
La tecnica di rivestimento più appropriata da utilizzare dipende dalle proprietà del campione, dalle dimensioni delle strutture che si desidera analizzare e dai metodi necessari per prepararlo per eseguire l'imaging all’EM. Per alcune applicazioni avanzate, è necessario eseguire il criodecapaggio ed eventualmente incidere i campioni. In tal caso è necessario utilizzare uno strumento in grado di eseguire il trasferimento a freddo, di rivestire il campione in condizioni criogeniche e fratturarlo con un coltello criogenico.
Dai rivestimenti realizzati in una macchina di rivestimento a polverizzazione a vuoto ridotto a temperatura ambiente a quelli realizzati a vuoto spinto fino a quelli a temperature criogeniche, le soluzioni di rivestimento Leica coprono un'ampia gamma di esigenze. Gli strumenti sono progettati per migliorare e ottimizzare i flussi di lavoro per la preparazione dei campioni, dai rivestimenti di base alle applicazioni più avanzate di criodecapaggio.
Qual è la differenza tra i rivestimenti preparati con una spalmatrice a vuoto spinto o a vuoto ridotto?
Le condizioni di vuoto hanno un impatto significativo sulla qualità della pellicola sottile.
Le spalmatrici a vuoto ridotto
consentono di deporre pellicole sottili in applicazioni SEM con requisiti di ingrandimento moderati. I campioni possono essere rivestiti con oro (Au) e altri materiali adatti come platino (Pt) e oro/palladio (Au/Pd).
Le spalmatrici a vuoto spinto
depositano pellicole sottili con una struttura a grana molto più fine per consentire di eseguire l'analisi SEM ad alta risoluzione. È altresì possibile eseguire la polverizzazione utilizzando una gamma più ampia di materiali, compresi i metalli ossidabili. Esempi di questi metalli sono l’iridio (Ir), il tungsteno (W) o il titanio (Ti). Talvolta, per formare uno strato tampone, si esegue la polverizzazione con il cromo (Cr). Inoltre, è possibile configurare le spalmatrici a vuoto spinto per utilizzarle in applicazioni più avanzate e per la deposizione multistrato.
In quali casi è opportuno rivestire di carbonio?
I rivestimenti di carbonio (C) vengono comunemente usati come pellicola di supporto per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Le pellicole sottili di carbonio sono tipicamente spesse pochi nanometri e vengono depositate su griglie TEM. Sono sottili, resistenti e trasparenti agli elettroni. Un rivestimento di carbonio viene utilizzato anche come strato protettivo.
Criodecapaggio
Per rivelare le strutture interne di un campione congelato, esso può essere fisicamente rotto per poter svelare tali strutture ed esaminarle con un microscopio elettronico. La crio spalmatrice Leica EM ACE900 porta la tecnica di criodecapaggio a un nuovo livello, caratterizzato da microtomo avanzato, opzioni di ombreggiatura flessibili con sorgenti a fascio di elettroni, uno stadio criogenico rotante e un sistema di trasferimento con blocco del carico. L'analisi ad alta risoluzione delle repliche nella TEM e l'imaging del fronte a blocchi nella SEM criogenica, in dotazione nel Leica EM VCT500, sono i risultati di questa tecnica. Il Leica EM ACE600 è dotato di uno stadio criogenico e di un collegamento VCT500 e rappresenta una soluzione per il criodecapaggio sull'immagine della superficie rivelata in una SEM criogenica.
Per quali applicazioni viene utilizzato il criodecapaggio?
Per poter rivelare le strutture fini interne di un campione biologico o organico, il campione deve essere raffreddato a temperature criogeniche e rotto fisicamente. Dopo essere state rivestite con uno strato conduttivo, è possibile esaminare le strutture fini esposte del campione con la microscopia elettronica (EM). Il criodecapaggio è un’operazione utilizzata tradizionalmente per applicazioni biologiche, quali l'analisi di strutture subcellulari, ad esempio organelli e membrane. Tuttavia, più recentemente la tecnica si è dimostrata interessante per alcune applicazioni nella scienza dei materiali e nella fisica riguardanti strati ed emulsioni.
Crioincisione
La crioincisione è un passaggio facoltativo che può essere eseguito dopo il criodecapaggio del campione e rivela ulteriori informazioni dalle facce fratturate. Questo risultato si ottiene dalla sublimazione sotto vuoto degli strati di ghiaccio superficiale per svelare quegli elementi cellulari originariamente nascosti. La temperatura e il vuoto della fase influenzano la velocità di incisione. Per ottenere la riproducibilità, è necessario controllare accuratamente la temperatura dello stadio. La crio spalmatrice Leica EM ACE900, uno strumento estremamente versatile, assicura i migliori risultati per le tecniche di frattura congelata e di liofilizzazione quando si esegue l’analisi TEM e l'analisi criogenica SEM.
