無標識のゼブラフィッシュの眼のオーバーレイ画像。 緑: 脂質成分の誘導ラマン散乱(SRS)画像(2850 cm⁻¹)。 赤: タンパク質成分のSRS画像 (2935 cm⁻¹)。 青: 主に強膜および角膜からの第二高調波シグナル。 サンプル提供 :Elena Remacha Motta氏、Julien Vermot氏、国立遺伝細胞分子生物学研究所(IGBMC)ストラスブール、フランス。

従来の方法ではアクセスできない画像ターゲットから新たな洞察を得る

従来の蛍光顕微鏡法は非常に優れた研究ツールですが、可視化できるターゲットの種類と数は限られています。 STELLARIS 8 CRS は、これらの制限の克服に役立ちます。

  • 化学結合を直接可視化することで、従来の方法ではほとんどアクセスできなかったイベントや構造をターゲットにすることができる; 
  • 複雑な3D試料の内部まで精細に観察できる3次元画像情報; 
  • 動的研究のための励起を最小限に抑え、可能な限り生理学的条件に近い状態に試料を維持することで、ビデオレートイメージングから繊細な試料の長期的な観察まで可能にする。

蛍光標識を必要とせずに構造や事象をイメージングする

STELLARIS 8 CRSは、化学的性質を利用して構造や事象を画像化し、区別することができる顕微鏡です。 これにより、従来の方法ではアクセスできない膨大な量の生化学、代謝、および薬物動態の情報にアクセスすることができます。 

コヒーレントラマン散乱では、試料に含まれる各分子固有の振動状態により画像コントラストが実現します。 したがって、試料を染色する必要はないため、退色や染色によるアーティファクトなどの、従来の観察方法における課題を解消できます。

マルチカラーSRSイメージングにより、ラマンタグ付き薬理化合物(黄色、2230cm-¹のSRSイメージング)の細胞内分布が、非標識の細胞サンプル内の内因性脂質やタンパク質との関係で明らかになる。 サンプル提供:Matthäus Mittasch博士, Dewpoint Therapeutics GmbH

脳組織の3次元イメージング : 200 μm 厚マウス脳切片の Z スタック。Thy1-YFP標識神経細胞(シアン)の2光子励起イメージと、有髄軸索(グロー)のSRS イメージの同時取得。 サンプル提供 : Monika Leischner-Brill博士、ミュンヘン工科大学神経細胞生物学研究所、ドイツ

3D サンプル用の内蔵3次元イメージング 

STELLARIS 8 CRS は、組織、オルガノイド、または無傷の小型モデル生物などの 3D サンプルを、その化学的特性を直接使用することにより、細胞レベル以下の分解能でイメージングするのに最適です。 CRSの特徴である後処理不要の3Dイメージングは、次の2つの機能の組み合わせによって実現されています。 

  • CRS シグナルは、励起レーザーの焦点空間内でのみ発生する非線形光学効果によって生成され、本質的な 3 次元画像情報を提供します。
  • CRSの励起に使用される近赤外レーザービームは、サンプル内を最小限の摂動で伝搬するため、無傷の3D試料の内部でも効率的なイメージングが可能です。

可能な限り生理学的な条件に近い状態で生体試料をイメージングする

CRSによる分子結合の高効率な励起は、化学的に特異な画像コントラストをかつてないスピードで実現します。 ビデオレートで生体試料を画像化することができます。 

STELLARIS 8 CRSは、タンデムスキャナを搭載しており、多くの試料の形態を高解像に、また、高速でイメージングすることができます。 

高速でよりダメージの少ない画像取得は、生体サンプルの状態を保ち、長期的な観察をするために不可欠です。 無染色のアプローチと近赤外線レーザーを使用することで、光毒性と光損傷を最低限に抑えることができます。 

生きた小腸のオルガノイドにおける、細胞以下レベルでの動態の無染色観察。 SRS シグナル (2940 cm⁻¹) のタイムラプス動画。内因性タンパク質と脂質を示しており、このモデルシステムにおける上皮細胞の組織化や脂質の液滴のダイナミクスについての知見が得られる。 サンプル提供 : Ruslan Dmitriev博士、ゲント大学、オランダ

非標識の脳組織に可視化されたアミロイドβプラークとそれに関連する病理学的な脂質沈着。 分光分析による解析では、近隣の健常な脳構造と比較して、膜脂質の濃縮とコレステロールの減少が確認されており、脂質代謝とアルツハイマー病の病態との関連を研究するための新たなきっかけを提供しています。 サンプル提供 : Martin Fuhrmann博士、Andrea Baral氏、ドイツ神経変性疾患センター、ボン

形態・化学・機能情報を加えたイメージング実験の可能性を探る

生命科学や基礎医学の研究で困難な課題に取り組むには、サンプルから得た情報を最大限に活用することが頻繁に必要です。 これには、脂質代謝の変化など、従来とは異なるターゲットのイメージングが必要な場合もあります。

STELLARIS 8 CRSは、共焦点蛍光の強度や寿命の情報に加えて、生化学的および生物物理学的なコントラストを幅広く取得し、相関させることができる完全に統合されたシステムを提供します。
 

サンプルの  生化学的組成に関する情報を取得

形態学的な情報と生化学的な情報の組み合わせは、健康な生体機能と疾患による変化を理解する上で非常に重要です。

STELLARIS 8 CRS は、これまでにない空間分解能で化学的コントラストによる無染色イメージングを提供します。 CRSでは、細胞内のオルガネラから組織内の細胞群、さらには組織の機能を阻害する病的な構造物まで、さまざまな空間スケールで生体機能を調べることができます。 

無処理の新鮮なリンゴ切片における内因性生化学組成を可視化。 (A) SRS 分光画像スタックの代表的なフレーム。 (B) (A) における関心領域のSRSスペクトル。 黄色 : 長鎖飽和脂肪酸のワックス状の相で構成されている最も外側の皮膜。 緑、赤 : 短鎖不飽和脂肪酸でできた内皮層。 青、マゼンタ : ポリフェノール化合物。 シアン : 多糖類でできた細胞壁。 オレンジ : カロテノイド色素。 (C) 生化学的に異なる構造を示す8色のスペクトルのアンミキシング結果。
ラベルフリーのSRSイメージングにより、多細胞皮膚がんスフェロイドモデルのコア-シェル構造が明らかになり、予想外の脂質リッチな細胞表現型(単離された明るい黄色の細胞)の出現が明らかになった。 サンプル提供 : Julia Klicks博士、Rüdiger Rudolf教授、マンハイム応用科学大学 、ドイツ

発生と疾病に関連する   新たな次元を明らかにする

健康や病気の生物学的プロセスを理解するには、細胞の表現型や代謝状態を直接可視化することが重要です。 サンプル処理によってこれらの特性が変わることがあるため、無染色のアプローチが望ましい選択肢になります。

CRSイメージングの分光機能により、本来の自然な姿に近い状態でサンプルを詳細に調べることができます。 

共焦点蛍光イメージングと化学イメージング   の組み合わせ

STELLARIS 8 CRSは、サンプルの複数の生物学的次元を比類なく把握するために、共焦点システムに強固に統合された複数のイメージング手法を提供します。 生化学的、生物物理学的、および分子的コントラストを持つマルチモーダルな光学イメージングを可能にします。 

  • 誘導ラマン散乱(SRS)
  • コヒーレントアンチストークスラマン散乱(CARS)
  • シングルフォトンまたはマルチフォトン蛍光
  • 第二高調波発生(SHG)
  • 赤外線(IR)、可視(VIS)、紫外線(UV)レーザーによる同時またはシーケンシャルモードのイメージング
     
可視共焦点蛍光イメージングと SRS による多色化学イメージングとの組み合わせ、および SHG による物理的なコントラストの追加によるマウス頭蓋骨形成のマルチモーダル光学イメージング。 1つのサンプルで、骨芽細胞の局在、細胞外コラーゲン繊維の堆積、骨ミネラルの形成が可視化される。 さらに、脂質を多く含む構造は、発達中の骨構造全体に散在する単離された骨芽細胞内で主に観察される。 サンプル提供 : Jacqueline Tabler氏、Sebastian Bundschuh氏、マックス・プランク分子細胞生物学・遺伝学研究所、ドレスデン、ドイツ。
左上 : 脳組織内の脂質のCARS顕微鏡画像。脂質が豊富な白色物質および灰色物質領域を示しています。 右上 : 光子の平均到着時間を示した画像において、脂質が豊富な白色物質での到着時間が短く、灰色物質での到着時間が長いことを示しています。 この結果は、瞬間的な CARSシグナルが、有限の寿命を持つ二光子自家蛍光シグナルを伴うことを示します。 最下列 : 瞬間的な CARSシグナルと、1.9 nsの平均到達時間をもつ自家蛍光シグナルを蛍光寿命を元に分離。 右 : オーバーレイ画像

振動および寿命イメージングによる新たな可能性を模索 

多くの生体試料は、内因性の蛍光体または意図的な蛍光標識に起因する蛍光を示します。 SRS シグナルは蛍光の影響を受けませんが、 CARS シグナルはある程度の蛍光クロストークを経る可能性があります。

STELLARIS プラットフォームの TauSense ツールは、この問題の解決に役立ちます。 蛍光寿命に基づいた情報を使用することで、瞬間的な CARS シグナルと蛍光シグナルを分離することができます。 

本質的に 定量化可能なデータによる生産性の向上

STELLARIS 8 CRS は、汎用性と使いやすさを兼ね備えた STELLARIS プラットフォームです。 この統合により、様々な困難なサンプルを扱うことができ、レシオメトリックおよび分光イメージングアプローチによる本質的に定量化可能なデータの取得など、CRSイメージングの利点を最大限に活かすことができるようになります。 

SRS 画像およびスペクトルデータ。ドデカン ( 完全飽和炭化水素、シアン ) およびリノール酸 ( 多価不飽和脂肪酸、マゼンタ ) の液滴を水に浸したもの。 1660 cm⁻¹ ~ 1440 cm⁻¹ の強度比は、脂質の不飽和の定量化を可能にします。

直感的な ImageCompass ユーザーインタフェースを使用して、数回クリックするだけで CRS 画像を取得できます。

完全に統合されたシステムにより簡単なセットアップ

実験のあらゆる面をImageCompassのユーザーインターフェースで完全に制御することができ、CRS顕微鏡のエキスパートと初心者の両方に、便利で直感的なアプローチを提供します。

さらに、 CRS レーザーコントロールを ImageCompass に統合することで、ユーザーは、たった数回クリックするだけで、単一化学結合イメージングから分光イメージングまたはマルチモーダルイメージングに切り替えることができます。 

大規模で複雑なサンプルを簡単にナビゲート

LAS X Navigatorは強力なナビゲーションツールで、画像ひとつずつの検索からサンプル全体像の表示にすばやく切り替えることができます。 CRS マルチポジション実験をナビゲーターに完全統合することで、大きなサンプルのフルタイルスキャンを実行し、その後のより詳細な調査のために関心領域を選択するために必要なすべての情報を提供します。

大規模な試料の自動イメージング : マウスの脳切片全体の高解像度のタイルスキャン。 高脂肪飼料で育ったマウスと通常の食事で育ったマウスの皮質組織領域を比較すると、高脂肪食事で育ったマウスでは病的、脂質が豊富な動脈プラークが起きていることが分かります。この現象は、通常の食事で育ったマウスには見られません。 サンプル提供 : ドイツ、ライプツィヒ大学 ジュディース・ライ氏、インゴ・ベックマン博士
SRS 分光画像は、脳構造の化学組成に関する詳細な情報を提供します。 左: SRS 画像は、アミロイド -β プラーク(左下 )を囲む健全で脂質が豊富な白色物質構造(上 )と病的脂質沈着物を示しています。 右 : SRS スペクトルは、より多くのコレステロールを含む白色物質と比較して、病的沈着物が膜脂質(スフィンゴマイエリン、ホスファチジルコリン)で強化されることを示しています。

ハイパースペクトルまたはレシオメトリック画像から定量化可能な情報

CRSは、ラマン分光法で開発された手法にヒントを得て、試料の化学組成について再現性と定量性のある情報を提供するレシオメトリック・イメージングと分光イメージングを可能にしました。 LAS X ソフトウェアには、この基本的な定量化ツールが組み込まれています。

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