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FLIM-FRET で分子間相互作用を追跡

現代の研究では、重要な作業を達成するために分子がどのように相互作用するかを検証します。 FLIM-FRET は、このような相互作用を明らかにするための金字塔的存在です。

STELLARIS 8 FALCON は、FLIM システムに対する新たな速度規格を打ち立てます。

極めて動的な細胞事象において FRET を可能にします。 日々の実験で FRET データを取得、解釈できます。

EPAC mT2-dVenus FRET センサーを発現する HeLa 細胞内の ケージド cAMP。 UV 媒介 cAMP アンケージングに対する EPAC 反応(中央領域)。 4 fps で撮影。 画像サイズ: 256 x 256 ピクセル。 カラーバースケール(寿命):ns。 提供:Kees Jalink、Bram van den Broek、NKI Amsterdam.

トロンビン活性化ペプチドによる刺激後のカルシウムオシレーション。 各細胞内の反応は寿命の変化として記録。 4 pfs で動画を取得。 画像サイズ: 256 x 256 ピクセル。 カラーバースケール(寿命):ns。 提供:Kees Jalink、Bram van den Broek、NKI Amsterdam.

バイオセンサーによって微細で高速な変化をモニタリング

バイオセンサーは、代謝活動、シグナリングメカニズム、pH、微細環境変化に対する強力な指標です。

STELLARIS 8 FALCON は、膜電位動態といった超高速な事象に対しても、蛍光寿命に含まれる情報へのアクセスを提供します。 この情報は、STELLARIS 8 system によって提供されるスペクトル蛍光強度イメージングと TauSense モードを補完します。

より信頼できる高感度な代謝イメージング

自家蛍光は、従来のイメージングにおいて問題になる可能性があります。  STELLARIS 8 FALCON は、それを貴重な情報へと変換します。 自家蛍光を代謝状態、細胞分化、がん発生に対する指標に変換できるようになりました。

さらに、STELLARIS 8 FALCON は、多くの場合、蛍光標識が曖昧な場合や生理学的条件を破壊する生体組織内においてイメージングコントラストを可能にします。 

非生理学的条件での哺乳類細胞における自家蛍光(pH 8.5)。 シグナルは NAD/NADH 内在性プールにおける変化と相関。 酸化ストレスの発達は、経時的な蛍光寿命の減少として読み取られる。 元の画像サイズ: 512 x 512 ピクセル。 カラーバースケール(寿命):ns。
強度
FLIM

スペクトルオプションを超えた蛍光色素分離

蛍光標識は、細胞内構造を区別するための標準的な手法です。 スペクトル分離は非常に有効な手法ですが、蛍光スペクトルが近すぎる場合、その分離が困難なことがあります。

STELLARIS 8 FALCON なら、指数関数フィッティング、パターンフィッティング、新しい FLIM フェーザー分離分析を使用することで蛍光寿命イメージングの可能性を最大限活かし、複数の蛍光プローブを分離できます。

インタラクティブな画像: 寿命コントラストによって識別された細胞骨格構造。 Alexa Fluor 555(緑)で免疫標識されたビメンチンと Alexa Fluor 546(青)で免疫標識されたチューブリン。 蛍光色素はスペクトル的には非常に類似しているものの、蛍光寿命情報を使用することで分離されています。 画像サイズ: 512 x 512 ピクセル。

高速な寿命イメージングに対応した STELLARIS 8 FALCON

STELLARIS 8 FALCON 顕微鏡は、FLIM の速度限界を克服し、高速な寿命データへの扉を開きます。

これまで高速な過程の蛍光寿命データから抽出される機能情報の取得は、FLIM の技術的制約により容易ではありませんでした。 FLIM 取得速度は、共焦点強度の記録に比べて少なくとも 10 倍遅いものでした。

STELLARIS 8 FALCON の高速な寿命コントラストイメージングを使用することで、適切な速度で細胞内の動的過程を追跡できます。 これらの作業を可能にしたのが、TCSPC(時間相関単一光子計数法)を使用した新時間測定法とデータ処理・分析のためのインテリジェントなアルゴリズムです。

Nature 内アプリケーションノート: SP8 FALCON:ビデオレート速度で共焦点 FLIM を可能にする蛍光寿命イメージングの革新的コンセプト

Alexa Fluor 555(緑)を含む溶液内の蛍光ビーズ(マゼンタ)のシングルチャンネル画像。 蛍光寿命に基づく蛍光色素分離は 16 fps(上)、27 fps(動画速度、中)、83 fps(超高速、下)等、さまざまな速度で可能。 色素分離に寿命情報を使用することは、蛍光強度(グレースケール)を使用するよりも有利です。 動画は寿命成分のピクセル単位のフィッティングを示しています。 フレームサイズ: 512 x 64 ピクセル。 スケールバー: 10 µm。
複雑なサンプルも簡単に取得。 190 メガピクセルの 722 タイルで構成された高解像度マウス胚モザイク画像。 4 つの特性蛍光寿命でフィッティング、色分けされた FLIM データ。 取得時間: 1:23 h。 解析時間: 1:00 h

オールインワンのマルチモードイメージング

STELLARIS 8 FALCON は、FLIM と他のモダリティの併用をかつてないほど容易にします。 研究者にはこれまで複雑な配線や、面倒なファイル転送といった作業が必要でした。 STELLARIS 8 FALCON によって、寿命情報を標準的な共焦点ワークフローに組み込めます。

STELLARIS 8 FALCON は、LAS X 取得・解析ソフトウェアに完全統合されています。 4 つのスペクトルチャンネルを同時に、最大 10 チャンネルを連続的に記録できます。 STELLARIS 8 FALCON は、3D スタック、タイムラプスシーケンス、さらには大型モザイクタイルフォーマットで寿命コントラストへのアクセスを提供します。

LAS X NAVIGATOR によって、最大 10,000 倍まで視野を拡大することで、関心領域の特定に要する時間を節約し、全く新しい方法でサンプルを研究できます。 

フェーザーによる簡単な寿命定義

FLIM フェーザーを使用した STELLARIS 8 FALCON   による分析は、寿命成分の 2D 視覚化を提供します。 FLIM フェーザーにより、微小環境の変化を追い、多重シグナルに対する成分を選択し、FRET 効率を求めることができます。

Alexa555-ファロイジンとH2B-mCherryにて蛍光標識された細胞。 FLIM Phasors機能を用いることで、蛍光波長が近しいAlexa555とmCherryを、蛍光寿命をもとに分離してそれぞれの分布を示すことができる。 フェーザープロットは2つの分布を明確に映し出しています。 提供: Dr. Martin Stöckl, Department of Biology, University Konstanz, Germany. 
1 クリック機能で、研究に集中: LAS X ソフトウェアによって制御される STELLARIS 8 FALCON。

必要な成果をワンクリックで

LAS X ソフトウェアはワンクリックと通常のスペクトルイメージングと同じ原理で FLIM を可能にします。

顕微鏡観察を補完的技法として用いている場合でも、基本的な機能を簡単に見つけ、すぐにイメージングをスタートできます。

より専門的な機能をワークフローとして利用でき、自動化することが可能です。

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