STED と STELLARIS: 超分解能を再び創造する

STED と STELLARIS はひとつの機器に統合され、優れた共焦点機能と超分解能の洞察力という利点を提供します。

POWER 

次世代 WLL、最適化されたビームパス、高速 Power HyD 検出器、最大3本の STED レーザーラインのユニークな組み合わせにより、ナノスケールとスペクトル全体にわたって複数の事象を同時に研究できます。

POTENTIAL

最先端の画質と穏やかな生細胞条件を提供する、蛍光寿命に基づいた STED への新しいアプローチである TauSTED によって、STED 超分解能イメージングを次のレベルまで引き上げます。

PRODUCTIVITY

新しい ImageCompass ユーザーインターフェイスにより、驚異的な共焦点と STED の画像を簡単に取得し、数回のクリックで実験を設定できます。

共焦点
TauSTED

STED の細胞生物学アプリケーション: TauSTED 775 によるマルチカラーライブセルイメージング、SiR-tubulin (グローカラー)によって標識された複雑な細胞骨格網と CF594(シアン)によって標識された小胞輸送を画像化。 スケールバー: 5 mm . SiR-tubulin は Spirochrome社より提供。 CF594 は Biotium, Inc より提供。

STELLARIS STED と STELLARIS 8 STED

STELLARIS にはシステムに STED を統合するための 2つのオプションがあります。 オールインワン STED ソリューションのSTELLARIS STEDと、自由なアップグレードを可能にする先進システムの STELLARIS 8 STED です。 どちらも同様の STED パフォーマンスを搭載しており、研究ニーズに最適な STELLARIS としての追加機能をオプションとして選択することができます。

STELLARIS 8 STED

STELLARIS 8 に搭載された STED の能力、最大 3本の STED ラインによる 2D/3D ナノスコープ観察を可能にする

  • 440 nm から最大 790 nm までの励起を可能にする WLL
  • Power HyD S、HyD X、そして赤色蛍光アプリケーションに HyD R が搭載可能
  • TauSense に基づいて TauSTED が可能。また、FALCON の搭載により、完全な FLIM 解析に対応
  • その他のモダリティへ自在にアップグレードが可能(FALCON、FCS)

STELLARIS STED

  • 最大 3本の STED ラインによる 2D/3D ナノスコープ観察に対応したオールインワン STED
  • 485 nm から最大 685 nm までの励起を可能にする WLL
  • Power HyD S と HyD X を搭載可能
  • TauSense に基づいた TauSTED が可能

試料のより詳細な分子関係を観察し、解像する能力

細胞輸送、分化、細胞 分裂などの過程の背景にあるメカニズムを明確にするには、自然状態の環境で特定の生体分子を 観察するための最高画質、実験設定の柔軟性、および速度が必要です。

STED は、STELLARIS プラットフォームとの組み合わせにより、次世代白色光レーザー (WLL)/AOBS 技術、新たに最適化されたビームパス、Power HyD 検出器ファミリーによるスペクトル検出、 複数のSTED ライン(592、660、775 nm)などの利点があります。 STED は、ナノスケールで構造を明らかにする鮮明な画像を、蛍光色素の自由な組み合わせによる共局在試験を、そして、非常にダイナミックなプロセスを追うことも可能にします。

マラリア研究における STED: 3D STED 775 による、赤血球のメロゾイト浸潤のメカニズム解明。 RON4(マゼンタ)と、PfRh5(左、緑色)、PfRipr(中央、緑色)、PfCyRPA(右、緑色)の各タンパク質のオーバーレイ画像。 核染色は青色、赤血球膜は灰色で表示。 スケールバー: 1 µm。 画像提供: Jennifer Volz 博士、Alan Cowman 博士、Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research、オーストラリア。Marko Lampe 博士、EMBL、ドイツ。

ナノスケールでいちどに観察できる事象の数を拡大する

複数の蛍光標識を使用することで分子特異的に異なる成分を画像化し、細胞内の分子の関係を明らかにすることが可能になります。

STED と STELLARISは、マルチカラーアプリケーションに優れた性能を発揮します。 スペクトルの赤色領域では最適な蛍光色素を、緑色領域では蛍光タンパク質を、オレンジ色領域では新規の蛍光プローブを利用することができます。 複数の蛍光色素を用いて共局在試験を行い、回折限界以下の分解能によってそれらを解像することができます。

ライカのスペクトル検出は、STED に対応した最大5基の Power HyD 検出器を搭載しており、時間と空間において観察する分子の数を拡大できます。 さらに、不感時間(デッドタイム)が 1.5ns と非常に短いPower HyD検出器のデジタル性能と応答速度は、シグナルノイズ比とバックグラウンドの観点から優れた画質を保証し、APD と比較して少なくとも10倍多く、ピクセル滞在時間あたりの光子収量を可能にします。

STED の発生生物学アプリケーション: ショウジョウバエ胚のホールマウントにおける RNA smFISH*。 直接標識プローブを使用。シグナル増幅なし。 上図: TauSTED 775 による 3重染色像、hb CalFluor 610(シアン)、gt Quasar 670(緑色)、eve Quasar 705(マゼンタ)。 下図: ショウジョウバエ胚ホールマウントの共焦点イメージング。 試料提供: Tom Pettini 博士、University of Manchester、英国。*一分子蛍光 in-situ ハイブリダイゼーション

卓越した明るさと解像度を備えた 2D/3D STED イメージング

STED と STELLARIS によって、分解能は x、y、z で調整可能になるため、2D と 3D の両方で必要な結果を取得できます。 2D と 3D における最高の明るさと分解能の取得を可能にするために、励起の最適なオーバーレイ、スペクトル全体にわたる STED PSF、適応的な補正によって定量化機能 が失われないことを保証する最高の光学系を提供します。 STED WHITE クラスの対物レンズは、さまざまな STED 実験にとって最適な条件を保証するため、特別に開発されています。

  • STED WHITE 100倍油浸レンズは、最高の分解能を提供し、固定試料の日常的なイメージングにおいて優れた性能を発揮します
  • STED WHITE 93倍グリセリン浸レンズは、motCORR 電動補正環技術により、試料深部を観察する際の温度変動、屈折率の不一致、不均質性に対する適応的な補正を提供します
  • motCORR を搭載した STED WHITE 86倍水浸レンズは、上述の適応的な補正を提供し、穏やかなライブセルイメージングと STED-FCS(1) に理想的です。

(1) 「High photon count rates improve the quality of super-resolution fluorescence fluctuation spectroscopy」 F. Schneider et al. J. Phys. D: Appl. Phys. 53 164003, 2020.

STED の細胞生物学アプリケーション: 3D TauSTED 660 により取得した画像。AF555 でヌクレオポリン複合体を免疫染色した COS7 細胞の核膜孔(NPCs)の分布。 一次抗体 mAb414 は、核小孔バスケットのヌクレオポリンを幾つか認識し、点状の染色を示す。 画像サイズ: 12 µm、z方向にカラーコード表示。

TauSTED: ナノスコープ観察と蛍光寿命の融合

ライカ独自のTauSTED 技術による卓越した分解能、画質、試料の保護により、STED 実験の可能性を広げることができます。

TauSTED は、STED によって生じる蛍光寿命の差を用いることで、STED により発生した光子とバックグラウンドを識別します。 その結果、大幅に少ない光量で従来の STED*を超えた分解能によるイメージングが可能になり、長時間のタイムラプス生細胞ナノスコープ観察を実現します。

TauSTEDは、あらゆる STED 実験、特にマルチカラー共局在実験に適応することができます。 さらには、FALCON によってスペクトル的に重なり合う STED 色素を分離することもできます。

*試料と蛍光色素に応じて、分解能 <30 nm(平面方向)、<100 nm(Z軸方向)。

共焦点
TauSTED

腎臓疾患研究における STED: シナプトポディン(緑)とネフリン(マゼンタ)を免疫染色したマウス腎臓(非透明化)の 2D/3D TauSTED 775 多重染色画像。 STED WHITE グリセリン浸レンズは最適な適応的補正により、非常に小さな組織構造におけるタンパク質を解像することを可能にする。 スケールバー: 10 μm. 試料提供:Victor Puelles 博士、Milagros Wong 博士、Jan Czogalla 博士、Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf、ドイツ。

TauSTEDは、非常に少ない光量で卓越した分解能を実現します

STED実験をなるべく低い光量で実施しようとする場合、次のような重要な質問があります。 なるべく低い光量とはどの程度ですか? その答えは、試料と選択した蛍光色素に依存するため、簡単なものではありません。

そのため、ユーザーの実験に関係のない任意の光量削減をお約束できるものではありません。 その代わりに、TauSTED が励起光と STED の光量を大幅に削減することで、時間と空間を超えて測定を成功させることができることをお見せすることができます。 TauSTED を使用することで、バックグラウンドを除去し、最高の分解能を得ることができます。また、より高い補正量や定量性の損失を回避することができます。

こうした利点は、STED と STELLARIS プラットフォームのユニークな組み合わせにより可能になります: 超高速 Power HyD 検出器と、TauSense(STELLARIS STED と STELLARIS 8 STED)と FLIM(STELLARIS 8 FALCON)によって実現する蛍光寿命へのアクセス。

STED の細胞生物学アプリケーション: TauSTED 660 により取得した画像。AF555 でヌクレオポリン複合体を免疫染色した COS7 細胞の核膜孔(NPCs)の分布。 わずか 2%の STED光で、より詳細に細部を明らかにすることができる。 一次抗体 mAb414 は、核小孔バスケットのヌクレオポリンを幾つか認識し、点状の染色を示す。

従来の限界を超えて分解能を高める

TauSTED は、あらゆる STED 実験において取得された蛍光寿命に基づいた情報を測定し、リアルタイムで蛍光色素の STED に対する応答をマッピングします。 この蛍光寿命情報へのアクセスは、いずれの励起波長と STED ライン(592、660、775)を使用した場合でも、画質(シグナルノイズ比)を向上し、物理的原理に基づいてバックグラウンド由来の光子を除去し、従来の輝度に基づいた STED の限界を超えて、分解能を高めることを可能にします。

TauSTED は、複雑な操作をすることなくこれらのプロセスを実行することができるため、ユーザーは試料に集中し、見逃しやすい細部も観察することができます。

STED による DNA 折り紙のイメージング: TauSTED 775 は、公称サイズが 23 nm の GATTA-Bead R において、30 nm 以下の分解能を実現します。 スケールバー: 1 µm。

ライブセルイメージングに適した穏やかな STED 超解像 ​

より少ない励起光とSTED光は、試料へのダメージ軽減につながります。

これにより空間分解能を犠牲にすることなく、より多くのフレーム、より大量のイメージングといった、長時間のタイムラプス実験を可能にします。 ​

STED の細胞生物学アプリケーション: LifeAct-mNeonGreen を安定発現する細胞を用いた、TauSTED 592 による穏やかなライブセルイメージング。 スケールバー: 5 µm。 230フレーム(1fps)のタイムラプスイメージング。 試料提供: Max Heydasch 博士、University of Bern、スイス。

STED-FLIM を使用した、重なり合うスペクトルを持つ蛍光色素の分離

STELLARIS 8 において STED と FALCON を組み合わせることで、蛍光寿命を使用して蛍光色素を分離できるため、最適な STED 蛍光色素(近赤外蛍光)によってマルチカラー超解像を実現できます。

これらの蛍光色素の蛍光スペクトルは非常に重なり合っているため、従来の輝度イメージングでは区別することはできません。 STED-FLIM と自動 Phasor 分離を組み合わせることで、蛍光色素が持つ特有の蛍光寿命をもとに、単独の検出器を使用して明確に分離することができます。

STED-FLIM の細胞生物学アプリケーション: STED 775 と FALCON の自動 Phasor 分離を用いて、重なり合うスペクトルを持つ蛍光色素を蛍光寿命をもとに分離。 HEK 細胞のビメンチンとアクチン。フォトンカウントによる輝度情報のみ(灰色)では、両方の構造を区別できないが、STED-FLIM によって明確に区別することができる(緑色:ビメンチン AF647、マゼンタ:アクチン ATTO 647N-ファロイジン)。 スケールバー: 4 µm。 試料提供: Sebastian Hänsch 博士、Stephanie Weidtkamp-Peters 博士、CAI、ドイツ・デュッセルドルフ。

簡単な STED の設定による生産性の向上

STELLARIS は、これから実験を始める研究者へも、実験のエキスパートにも STED への簡単なアクセスを提供します。 たった数回のクリックで、共焦点とマルチカラーに加え、2Dと3D STED を組み合わせた実験を設定することができます。

  • 試料の特性に注目した ImageCompass のスマートなガイダンスにより、信頼できる結果を得ることができます。
  • ワンクリックでできるレーザー自動アライメントによって最高の STED 性能を保つことができます。アライメント中は試料にレーザーが照射されることなく、完全に自動化された方法でレーザー照射の最適な位置決めをすることができます。
  • LAS X Navigator で広い領域を素早くイメージングし、STED イメージングの対象領域を選択することができます。
  • Raw データへのアクセスと、迅速で効率的なフォトンカウンティングなどの STELLARIS の機能により、取得した結果を検証することができます。
STELLARIS の STED 用 ImageCompass ユーザーインターフェイス。

ひとつのプラットフォームで迅速に結果を検証する

STED と STELLARIS の組み合わせにより、結果の検証に STED、共焦点、LIGHTNING、TauSense の全てのデータを同じシステムで利用することができます。

また、Raw データにアクセスして、定量化することができます。 TauSTED は、蛍光寿命情報の物理的な読み取りにより、バックグラウンドの除去と分解能の調整を可能にします。

STELLARIS によって、ナノスコープ実験を常に制御することができます。

STED の微生物学アプリケーション: 共焦点、LIGHTNING、STED イメージングによって可視化されたバクテリア鞭毛の三重染色画像。補完的手法を用いることで、試料の調査と検証を可能にする。 試料提供: Marc Erhardt 博士、Humboldt-Universität、ドイツ・ベルリン。

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