従来の方法ではアクセスできなかったターゲットを画像化する力を得る

従来の蛍光顕微鏡法は非常に優れた研究ツールですが、可視化できるターゲットの種類や数は限られています。STELLARIS CRSは、これらの制限を克服するのに役立ちます:

  • 化学的に特異的な内因性コントラストを利用して、従来の方法ではほとんどアクセスできない構造やプロセスを可視化する。
  • 複雑な3次元標本内部も細部まで観察可能な3次元画像情報を取得。
  • ビデオレートイメージングから高感度試料の長期観察まで、可能な限り生理学的条件に近い状態に維持されたダイナミックな研究において、最小限の摂動励起の恩恵を受けることができます。
非標識ゼブラフィッシュの無処理の眼球を示すオーバーレイ画像。緑色:脂質成分の誘導ラマン散乱(SRS)画像(2850cm-¹)。赤:タンパク質成分のSRS画像(2935 cm-¹)。青:主に強膜と角膜からの第二高調波シグナル。サンプル提供:Elena Remacha Motta、Julien Vermot、Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology (IGBMC), Strasbourg, France。
非標識ゼブラフィッシュの無処理の眼球を示すオーバーレイ画像。緑色:脂質成分の誘導ラマン散乱(SRS)画像(2850cm-¹)。赤:タンパク質成分のSRS画像(2935 cm-¹)。青:主に強膜と角膜からの第二高調波シグナル。サンプル提供:Elena Remacha Motta、Julien Vermot、Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology (IGBMC), Strasbourg, France。

生きたサンプル中の複雑な生物学的プロセスを追跡

高速チューニングのpicoEmerald FT 光源を用いたSTELLARIS CRSの高速マルチプレックスケミカルイメージング機能を活用することで、複数の化学種のダイナミクスを数秒のタイムスケールで追跡します。

ビデオサンプル提供:Dr. Matthew Benton, EMBL Heidelberg。

発生過程のショウジョウバエ胚の高速マルチプレックスケミカルイメージング。タンパク質(赤、SRS 2940 cm-¹)、脂質(緑、SRS 2850 cm-¹)、第二高調波発生と内因性2光子蛍光(青)の組み合わせ。タイムラプスムービー、16秒/タイムステップ、撮影時間2時間3分(441タイムステップ)。サンプル提供:Dr. Matthew Benton, EMBL Heidelberg。

統計的に有意な生化学的画像データを短時間で取得

発生過程や疾患により、細胞や組織の代謝状態が変化する。これらの代謝状態は、内因性の生化学的組成や細胞小器官の空間構成に反映されます。 

STELLARIS CRSにより、ユーザーは12cmの分光イメージングでこの生化学的事象を調査することができます。-1スペクトル分解能。 

これまでの装置と比較して、シグナルの質が大幅に改善され、レーザーチューニングが高速化された結果、マルチプレックス化学イメージングが桁違いに高速化され、ユーザーは統計的に有意な生化学画像データを短時間で取得できるようになりました。

二次元細胞培養(コレステロールを添加したU2OS細胞)のSRSスペクトルスキャン(2800~3100cm-¹、38スペクトルポイント)のアンミキシング結果。脂質滴(黄色)、コレステロール沈着(マゼンタ)、細胞核(シアン)、水性緩衝液(青色)を示す。
二次元細胞培養(コレステロールを添加したU2OS細胞)のSRSスペクトルスキャン(2800~3100cm-¹、38スペクトルポイント)のアンミキシング結果。脂質滴(黄色)、コレステロール沈着(マゼンタ)、細胞核(シアン)、水性緩衝液(青色)を示す。

蛍光色素を使わずに構造や事象を画像化

STELLARIS CRS顕微鏡は、化学的性質を利用して構造や事象を画像化し、区別することができる。これにより、従来の方法ではアクセスできなかった膨大な量の生化学的、代謝学的、薬物動態学的情報にアクセスすることができます。 

CRSの画像コントラストは、検体中の異なる分子の特徴的な固有の振動状態によってもたらされる。従って、被検体を染色する必要がなく、光退色や染色アーティファクトといった色素ベースのイメージング法の欠点が解消される。

マルチカラーSRSイメージングにより、ラマン標識された薬理学的化合物(黄色、2230 cm-¹におけるSRSイメージング)の細胞内分布が、非標識細胞サンプル内の内因性脂質とタンパク質との関連において明らかになる。サンプル提供:Dr. Matthäus Mittasch, Dewpoint Therapeutics GmbH。
マルチカラーSRSイメージングにより、ラマン標識された薬理学的化合物(黄色、2230 cm-¹におけるSRSイメージング)の細胞内分布が、非標識細胞サンプル内の内因性脂質とタンパク質との関連において明らかになる。サンプル提供:Dr. Matthäus Mittasch, Dewpoint Therapeutics GmbH。

3Dサンプルのためのビルトイン3次元イメージング 

STELLARIS CRSは、組織、オルガノイド、インタクトな小型モデル生物などの3Dサンプルを、その化学的性質を直接利用することにより、細胞内解像度でイメージングするのに完璧に適しています。後処理を必要としない3Dイメージングは、2つの機能の組み合わせにより、CRSに組み込まれています: 

  • CRS シグナルは、励起レーザーの焦点空間内でのみ発生する非線形光学効果によって生成され、本質的な 3 次元画像情報を提供します。
  • CRSの励起に使用される近赤外レーザービームは、サンプル内を最小限の摂動で伝搬するため、無傷の3D試料の内部でも効率的なイメージングが可能です。
脳組織の3次元イメージング:有髄軸索のSRSイメージング(グロー)とThy1-YFP標識神経細胞からの2光子蛍光(シアン)を同時に示す、厚さ200μmのマウス脳スライスのZスタック。サンプル提供:Dr. Monika Leischner-Brill, Institute of Neuronal Cell Biology, TU München, Germany。

生理学的条件に限りなく近い状態で生きた試料を画像化

CRSによる分子結合の高効率励起は、化学的に特異的な画像コントラストをかつてないスピードで提供します。ビデオレートでの生きた試料のイメージングを可能にします。 

STELLARIS CRSにはタンデムスキャナーが搭載されており、多くの試料形態に対して、従来のイメージングと高速イメージングの両方が可能です。 

スピードだけでなく、長期観察中の生きたサンプルを保存するためには、穏やかなイメージングが不可欠です。ラベルフリーアプローチと近赤外レーザーの使用により、光毒性と光ダメージを最小限に抑えます。 

生きた小腸オルガノイドの細胞内動態をラベルフリーで調べる。SRSシグナル(2940cm-¹)のタイムラプス動画は、内因性タンパク質と脂質を示しており、このモデル系における上皮細胞組織と脂質液滴のダイナミクスに関する洞察を与えている。サンプル提供:Dr. Ruslan Dmitriev, Ghent University, Belgium。

イメージング実験における形態化学的および機能的情報の可能性を探る

ライフサイエンスや基礎医学研究において困難な問題に取り組むためには、サンプルから得られる情報を最大限に活用することが頻繁に必要となります。これにはしばしば、脂質代謝の変化のような、従来とは異なるターゲットのイメージングの必要性が含まれます。

STELLARIS CRSは、共焦点蛍光輝度および寿命情報に加えて、幅広い生化学的および生物物理学的コントラストを取得し、相関させることができる完全に統合されたシステムを提供します。
 

非標識脳組織で可視化されたアミロイドβ斑と関連する病理学的脂質沈着。分光学的解析により、近傍の健康な脳構造と比較して、膜脂質が濃縮され、コレステロールが枯渇していることが示され、脂質代謝とアルツハイマー病病理学との関連を研究する新たな窓が提供された。サンプル提供:Dr. Martin Fuhrmann, Andrea Baral, German Center for Neurodegenerative Diseases, Bonn。
非標識脳組織で可視化されたアミロイドβ斑と関連する病理学的脂質沈着。分光学的解析により、近傍の健康な脳構造と比較して、膜脂質が濃縮され、コレステロールが枯渇していることが示され、脂質代謝とアルツハイマー病病理学との関連を研究する新たな窓が提供された。サンプル提供:Dr. Martin Fuhrmann, Andrea Baral, German Center for Neurodegenerative Diseases, Bonn。

 、サンプルの生化学的組成に関する情報を得ることができます。

形態学的情報と生化学的情報の組み合わせは、健康な生物学的機能と疾患による変化を理解する上で極めて重要です。

STELLARIS CRSは、前例のない空間分解能で、化学的コントラストによるラベルフリーイメージングを提供します。CRSにより、細胞内小器官から組織内の細胞グループ、あるいは組織機能を乱す病的構造まで、多くの空間スケールで生物学的機能を調査することができます。 

未処理の新鮮なリンゴスライスの内因性生化学組成の可視化。(A)SRS分光画像スタックの代表フレーム。(B)(A)の関心領域のSRSスペクトル。黄色:長鎖飽和脂肪酸のワックス状相からなる最外皮。緑、赤:短鎖不飽和脂肪酸からなる内側のクチクラ層。青、マゼンタ:ポリフェノール化合物。シアン:多糖類からなる細胞壁。オレンジ:カロテノイド色素。(C)生化学的に異なる構造を示す8色スペクトルアンミキシングによる結果。
未処理の新鮮なリンゴスライスの内因性生化学組成の可視化。(A)SRS分光画像スタックの代表フレーム。(B)(A)の関心領域のSRSスペクトル。黄色:長鎖飽和脂肪酸のワックス状相からなる最外皮。緑、赤:短鎖不飽和脂肪酸からなる内側のクチクラ層。青、マゼンタ:ポリフェノール化合物。シアン:多糖類からなる細胞壁。オレンジ:カロテノイド色素。(C)生化学的に異なる構造を示す8色スペクトルアンミキシングによる結果。

 発生と疾病に関連する新たな次元を明らかにする。

細胞の表現型や代謝状態を直接可視化することは、健康や疾患における生物学的プロセスを理解する上で重要である。サンプルの処理によってこれらの特性が変化する可能性があるため、ラベルフリーのアプローチが望ましい選択肢となります。

CRSイメージングでは、可能な限り自然な状態に近い条件下でサンプルの詳細な研究を可能にする分光機能を提供します。 

無標識SRSイメージングにより、多細胞皮膚がんスフェロイドモデルのコアシェル構造が明らかになり、予想外の脂質に富んだ細胞表現型(孤立した明るい黄色の細胞)が出現した。サンプル提供:Dr. Julia Klicks, Prof. Rüdiger Rudolf, Hochschule Mannheim, Germany。
無標識SRSイメージングにより、多細胞皮膚がんスフェロイドモデルのコアシェル構造が明らかになり、予想外の脂質に富んだ細胞表現型(孤立した明るい黄色の細胞)が出現した。サンプル提供:Dr. Julia Klicks, Prof. Rüdiger Rudolf, Hochschule Mannheim, Germany。

共焦点蛍光イメージング ケミカルイメージングとの組み合わせ

STELLARIS CRSは、サンプルの生物学的な多次元を比類なく観察するために、共焦点システムに緊密に統合されたいくつかのイメージングメソッドを提供します。これらは、生化学的、生物物理学的、分子コントラストを持つマルチモーダル光学イメージングを可能にします。 

  • 誘導ラマン散乱(SRS)
  • コヒーレントアンチストークスラマン散乱(CARS)
  • シングルフォトンまたはマルチフォトン蛍光
  • 第二高調波発生(SHG)
  • 赤外線(IR)、可視(VIS)、紫外線(UV)レーザーによる同時またはシーケンシャルモードのイメージング
     
可視共焦点蛍光顕微鏡とSRSによるマルチカラーケミカルイメージング、およびSHGによる物理的コントラストの追加を組み合わせた、マウス頭蓋骨摘出における骨形成のマルチモーダル光学イメージング。一つのサンプルで、骨芽細胞の局在、細胞外コラーゲン線維の沈着、骨ミネラルの形成が可視化される。さらに、脂質に富んだ構造が、発達中の骨構造全体に散在する孤立した骨芽細胞内に主に観察される。サンプル提供:Jacqueline Tabler and Sebastian Bundschuh, MPI-CBG Dresden, Germany。
可視共焦点蛍光顕微鏡とSRSによるマルチカラーケミカルイメージング、およびSHGによる物理的コントラストの追加を組み合わせた、マウス頭蓋骨摘出における骨形成のマルチモーダル光学イメージング。一つのサンプルで、骨芽細胞の局在、細胞外コラーゲン線維の沈着、骨ミネラルの形成が可視化される。さらに、脂質に富んだ構造が、発達中の骨構造全体に散在する孤立した骨芽細胞内に主に観察される。サンプル提供:Jacqueline Tabler and Sebastian Bundschuh, MPI-CBG Dresden, Germany。

振動イメージングとライフタイムイメージングで新たな可能性を探る 

多くの生体試料は、内因性の蛍光色素または意図的な蛍光標識による蛍光シグナルを示します。SRSシグナルが蛍光の影響を受けないのに対して、CARSシグナルはある程度の蛍光クロストークをおこす可能性があります。

STELLARISプラットフォームのTauSenseツールは、この問題を解決するのに役立ちます。蛍光寿命ベースの情報を使用することで、瞬間的にCARSシグナルと蛍光シグナルを分離することができます。 

左上:脳組織中の脂質のCARS顕微鏡像。脂質に富む白質と灰白質の領域を示す。右上:平均光子到達時間画像から、脂質に富む白質からの到達時間は短く、灰白質からの到達時間は長いことがわかる。この結果は、瞬間的なCARSシグナルが、有限の寿命を持つ2光子自家蛍光シグナルを伴っていることを示している。下段:平均到達時間1.9 nsの瞬間CARSシグナルと自家蛍光シグナルの寿命に基づく分離。右:オーバーレイ画像。
左上:脳組織中の脂質のCARS顕微鏡像。脂質に富む白質と灰白質の領域を示す。右上:平均光子到達時間画像から、脂質に富む白質からの到達時間は短く、灰白質からの到達時間は長いことがわかる。この結果は、瞬間的なCARSシグナルが、有限の寿命を持つ2光子自家蛍光シグナルを伴っていることを示している。下段:平均到達時間1.9 nsの瞬間CARSシグナルと自家蛍光シグナルの寿命に基づく分離。右:オーバーレイ画像。

 定量化可能なデータで生産性を向上させます。

STELLARIS CRSは、STELLARISプラットフォームで利用可能なすべての汎用性と使いやすさを提供します。この統合により、様々な困難なサンプルに対応し、レシオメトリックおよび分光イメージングアプローチから本質的に定量可能なデータを得るなど、CRSイメージングの利点を最大限に引き出すことができます。 

水に浸したドデカン(完全飽和炭化水素、シアン)とリノール酸(多価不飽和脂肪酸、マゼンタ)の液滴のSRS画像とスペクトル。1660 cm-¹と1440 cm-¹の強度の比から、脂質の不飽和度を定量することができる。
水に浸したドデカン(完全飽和炭化水素、シアン)とリノール酸(多価不飽和脂肪酸、マゼンタ)の液滴のSRS画像とスペクトル。1660 cm-¹と1440 cm-¹の強度の比から、脂質の不飽和度を定量することができる。

完全に統合されたシステムで実験を簡単にセットアップ

実験のあらゆる側面がImageCompassのユーザーインターフェースで完全に制御されるため、CRS顕微鏡のエキスパートにも初心者にも便利で直感的なアプローチを提供します。

さらに、CRSレーザーコントロールがImageCompassに統合されているため、シングルケミカルボンドイメージングから分光イメージングやマルチモーダルイメージングまで、わずか数クリックで行うことができます。 

直感的な ImageCompass ユーザーインタフェースを使用して、数回クリックするだけで CRS 画像を取得できます。

大きくて複雑なサンプルを簡単にナビゲート

LAS X Navigatorは、画像ごとの検索からサンプルの全体像の表示まで、素早く切り替えられるパワフルなツールです。CRSマルチポジション実験とNavigatorの完全な統合により、大きなサンプルのフルタイルスキャンを行うことができ、その後の詳細な調査に必要な関心領域の選択に必要なすべての情報を提供します。

大面積サンプルの自動イメージング:ここに示すのは、マウスの脳スライス全体の高解像度タイルスキャンである。高脂肪食と普通食で育ったマウスの対応する皮質組織領域を比較すると、高脂肪食では病的で脂質に富んだ動脈斑が発生するが、普通食では発生しないことがわかる。サンプル提供:Judith Leyh and Prof. Ingo Bechmann, Universität Leipzig, Germany。
大面積サンプルの自動イメージング:ここに示すのは、マウスの脳スライス全体の高解像度タイルスキャンである。高脂肪食と普通食で育ったマウスの対応する皮質組織領域を比較すると、高脂肪食では病的で脂質に富んだ動脈斑が発生するが、普通食では発生しないことがわかる。サンプル提供:Judith Leyh and Prof. Ingo Bechmann, Universität Leipzig, Germany。

ハイパースペクトルまたはレシオメトリックイメージングからの定量可能な情報

CRSは、ラマン分光学のコミュニティによって開発されたアプローチに触発され、試料の化学組成に関する再現可能で定量可能な情報を提供するレシオメトリックおよび分光イメージングを可能にします。これらの基本的な定量化ツールはLAS Xソフトウェアに統合されています。

SRS分光イメージングにより、脳構造の化学組成に関する詳細な情報が得られる。左:健康で脂質の豊富な白質構造(上)とアミロイドβプラークを囲む病的な脂質沈着(左下)を示すSRS画像。右:SRSスペクトルは、コレステロールが豊富な白質と比較して、病理学的沈着物は膜脂質(スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン)に富んでいることを示している。
SRS分光イメージングにより、脳構造の化学組成に関する詳細な情報が得られる。左:健康で脂質の豊富な白質構造(上)とアミロイドβプラークを囲む病的な脂質沈着(左下)を示すSRS画像。右:SRSスペクトルは、コレステロールが豊富な白質と比較して、病理学的沈着物は膜脂質(スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン)に富んでいることを示している。
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