Microscopía correlativa óptica y electrónica (CLEM)
Imagine que se pudiese salvar fácilmente la brecha entre la escala micrométrica y nanométrica, conectando la información funcional y ultraestructural. En el marco de un experimento, esto implica utilizar diferentes técnicas de microscopía y preparación de muestras para combinar múltiples modalidades, como la obtención de imágenes de células vivas, la vitrificación por alta presión, la ultramicrotomía y la microscopía electrónica (criogénica). La tecnología de correlativa CLEM ayuda a cerrar esta brecha.
Las soluciones CLEM de Leica Microsystems garantizan la viabilidad de las muestras, la calidad de las comprobaciones y un mecanismo de localización 3D preciso y fiable. Los usuarios pueden utilizar estas soluciones para identificar directamente la célula adecuada en el momento adecuado, obtener imágenes confocales en crio de alta resolución o colocar la información de fluorescencia en el contexto ultraestructural.
Nuestros expertos en soluciones para microscopía correlativa óptica y electrónica estarán encantados de ayudarle con su asesoramiento.
¿Para qué se utiliza la correlativa CLEM?
La tecnología de correlativa CLEM se utiliza para investigar más a fondo una muestra con resolución subnanométrica, lo que no solo permite la combinación de diferentes niveles de información de una región, sino también la localización específica de una región de interés en el volumen, por lo que es como contar con un faro al deambular por la oscuridad.
Por ejemplo, una proteína marcada puede detectarse y dirigirse fácilmente mediante microscopía de fluorescencia criogénica para un análisis más detallado de la estructura de la proteína mediante el uso de Cryo-EM (más información sobre Coral Cryo). Otro ejemplo es cuando se desea combinar información dinámica (por ejemplo, interacción célula-célula) con información estructural e ir más allá del límite de resolución de la microscopía óptica (más información sobre Coral Life).
A pesar de lo sencillo que parece, la creación de un flujo de trabajo CLEM (criogénico) fluido y exitoso plantea múltiples retos. Ya en la fase de diseño experimental, los usuarios deberán plantearse las siguientes preguntas:
- ¿Cómo preparar y mantener la muestra en un estado óptimo?
- ¿Cómo identificar y marcar las estructuras objetivo de interés?
- ¿Cómo transferir la muestra de forma segura y eficiente entre diferentes instrumentos?
- ¿Cómo proporcionar la obtención de imágenes y los datos deseados en un formato adecuado para los pasos posteriores de microscopía electrónica?
La familia de productos Coral le ayuda a manipular su muestra paso a paso, lo que garantiza una mayor fiabilidad de su flujo de trabajo de correlativa CLEM.
¿Cómo se correlacionan los datos de la CLEM?
La microscopía correlativa óptica y electrónica es fundamental para realizar correctamente un experimento, tanto para experimentos a temperatura ambiente como de cryo-EM. Los sistemas de coordinación deben establecerse y reconocerse bien con diferentes modalidades de toma de imágenes. A continuación, la información de la imagen se superpone mediante el ajuste de la imagen (para grandes imágenes en mosaico) o la coordinación absoluta de las posiciones (valores «x», «y» y «z») para recuperar información de alta resolución con alta precisión.
¿Qué es Crío-CLEM?
En Crío-CLEM (microscopía correlativa óptica y electrónica), los dos pasos de obtención de imágenes se realizan en condiciones criogénicas, lo que implica la necesidad de un flujo de trabajo de preparación de muestras criogénicas fiable. Esto incluye una vitrificación fiable de las muestras, un transporte seguro de las muestras y una obtención estable de imágenes criogénicas con microscopía óptica. Se debe prestar especial atención a la contaminación por hielo: los entornos con un elevado nivel de humedad y el LN2 contaminado pueden poner fácilmente su muestra en riesgo. Coral Cryo ofrece: 1) Manipulación segura y limpia de sus muestras. 2) Obtención de imágenes criogénicas de microscopía óptica estable y a largo plazo. 3) Obtención de imágenes y localización precisa de biomoléculas en su entorno nativo mediante el software Coral Cryo.
Presentación del flujo de trabajo Coral Life
La obtención de imágenes de células vivas mediante microscopía con fluorescencia es una forma ampliamente utilizada de visualizar procesos celulares a lo largo del tiempo. Sin embargo, hay casos en los que la información obtenida mediante microscopía óptica sencillamente no basta para proporcionar información sobre los mecanismos celulares. En ese caso, se requiere claramente una imagen de la ultraestructura en alta resolución, proporcionada por (RT) EM.
El flujo de trabajo Coral Life de Leica Microsystems permite realizar un seguimiento por imágenes de eventos celulares raros a lo largo del tiempo utilizando microscopía de fluorescencia en un entorno fisiológicamente seguro. Una vez que se produce el evento de interés, puede vitrificar su muestra en tan solo cinco segundos para un análisis posterior en RT EM (TEM, SEM, FIB/SEM).
Optimiza la transferencia de muestras desde entornos de cultivo celular mantenidos cuidadosamente hasta imágenes de fluorescencia y vitrificación rápida mediante vitrificación por alta presión. El flujo de trabajo de células vivas a vitrificación de Coral Life permite capturar eventos raros de células cuando suceden, lo que los pone a disposición para el análisis por EM.
