Was ist FLIM - Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy?

Kuschel, Lioba; DeRose, James

October 17, 2022

Was ist FLIM - Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy?

FLIM nutzt die Fluoreszenzlebensdauer, die misst, wie lange ein fluoreszierendes Molekül oder Fluorophor durchschnittlich in seinem angeregten Zustand bleibt, bevor es durch Aussenden eines Fluoreszenzphotons wieder in seinen Grundzustand zurückkehrt. Die Emission eines Fluoreszenzphotons von einem Fluorophor erfolgt nicht immer zu einem exakten Zeitpunkt nach der Anregung. Vielmehr wird eine Zeitspanne beobachtet, die durch eine exponentielle Abklingfunktion beschrieben werden kann. Die charakteristische Beständigkeit dieses Zerfalls, die Fluoreszenzlebensdauer, liegt im Bereich von einigen Pikosekunden (1-10 ps) bis zu einigen zehn Nanosekunden (10-100 ns).

Fluoreszenzlebensdauer als Tester für die Nano-Umgebung

Diese Lebensdauer ist ein charakteristischer Parameter jedes fluoreszierenden Farbstoffs oder Moleküls, die sich mit seiner nanoskopischen Umgebung oder seinem Konformationszustand ändern können. Die Informationen über die Lebensdauer geben Aufschluss über die Zusammensetzung der molekularen Umgebung, wie z. B. Ionenkonzentration, pH-Wert, Lipophilie oder die Bindung an andere Moleküle.

Kombination von Lebensdauermessung und Bildgebung

FLIM kombiniert Lebensdauermessungen mit Bildgebung: Die auf Pixelebene ermittelten Lebensdauern werden farbkodiert, um Bilder zu generieren. Somit liefert FLIM Informationen über die räumliche Verteilung eines fluoreszierenden Moleküls zusammen mit Informationen über seine Nano-Umgebung. So erhält man eine weitere Datendimension.

Grundlagen der FLIM-Datenerfassung und -analyse

Wiederholte Erfassung der Zeit zwischen der Laseranregung des Fluorophors und dem Eintreffen der Fluoreszenzphotonen an jedem Pixel eines Detektors (siehe Abbildung 1A).
Die Berechnung eines Histogramms der Photonenzahl gegen die Ankunftszeit nach dem Laserpuls.
Zuordnung der exponentiellen Abklingkurve, F(t) = A0 exp (-t/τ), zu jedem Histogramm. Die Amplitude, F(t), spiegelt die Gesamtzahl der zu einem bestimmten Zeitpunkt detektierten Photonen wider. Die Zeitkonstante, τ, wird als Fluoreszenzlebensdauer bezeichnet (siehe Abbildung 1B).
Die Bilder der Lebensdauer werden mit einer beliebigen Farbe für jeden Wert der Lebensdauer dargestellt (siehe Abbildung 1C).

Abb. 1: A) Schema der wiederholten Messung der Ankunftszeit der Fluoreszenzphotonen, die zwischen der Laseranregung und der Detektion der Photonenemission verstreicht. B) Berechnung eines Histogramms der Photonenzahl gegenüber der Ankunftszeit nach dem Laserpuls. Zuordnung einer exponentiellen Abklingkurve zum Histogramm, wobei die Amplitude die Gesamtzahl der Photonen widerspiegelt und die Zeitkonstante τ die Fluoreszenzlebensdauer ist. C) Einfaches Beispiel eines Fluoreszenzlebensdauerbildes, das zeigt, wie mit Hilfe einer Nachschlagetabelle mit beliebigen Farben für die verschiedenen Lebensdauern (τ1, τ2, usw.) diese dargestellt werden.

Lösung für FLIM

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Intensitäts- und FLIM-Bild von U2OS-Zellen, die mit α-Tubulin (AF546) und Vimentin (AF555) immungefärbt wurden [1]. Der Maßstab ist 5 µm und der Farbbalken 0-3 ns.

References

L. Alvarez, B. Widzgowski, B. van den Broek, G. Ossato, K. Jalink, L. Kuschel, J. Roberti, F. Hecht: A novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal FLIM: With SP8 FALCON, Science Lab (2019) Leica Microsystems.