Was ist FLIM - Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy?

Fluoreszenzlebensdauer als Tester für die Nano-Umgebung

Diese Lebensdauer ist ein charakteristischer Parameter jedes fluoreszierenden Farbstoffs oder Moleküls, die sich mit seiner nanoskopischen Umgebung oder seinem Konformationszustand ändern können. Die Informationen über die Lebensdauer geben Aufschluss über die Zusammensetzung der molekularen Umgebung, wie z. B. Ionenkonzentration, pH-Wert, Lipophilie oder die Bindung an andere Moleküle.

Kombination von Lebensdauermessung und Bildgebung

FLIM kombiniert Lebensdauermessungen mit Bildgebung: Die auf Pixelebene ermittelten Lebensdauern werden farbkodiert, um Bilder zu generieren. Somit liefert FLIM Informationen über die räumliche Verteilung eines fluoreszierenden Moleküls zusammen mit Informationen über seine Nano-Umgebung. So erhält man eine weitere Datendimension.

Grundlagen der FLIM-Datenerfassung und -analyse

1. Wiederholte Erfassung der Zeit zwischen der Laseranregung des Fluorophors und dem Eintreffen der Fluoreszenzphotonen an jedem Pixel eines Detektors (siehe Abbildung 1A).
2. Die Berechnung eines Histogramms der Photonenzahl gegen die Ankunftszeit nach dem Laserpuls.
3. Zuordnung der exponentiellen Abklingkurve, F(t) = A0 exp (-t/τ), zu jedem Histogramm. Die Amplitude, F(t), spiegelt die Gesamtzahl der zu einem bestimmten Zeitpunkt detektierten Photonen wider. Die Zeitkonstante, τ, wird als Fluoreszenzlebensdauer bezeichnet (siehe Abbildung 1B).
4. Die Bilder der Lebensdauer werden mit einer beliebigen Farbe für jeden Wert der Lebensdauer dargestellt (siehe Abbildung 1C).